中国生物工程杂志

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唐娟,蒋建利,周宏伟,熊华,杨向民,陈志南

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 1-4.

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目的：构建βig-h3基因真核表达载体pEGFP-C2 /βig-h3并转染人7721肝癌细胞，检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。方法：用RT—PCR方法获得βig-h3基因，以pEGFP-C2为载体，构建重组表达质粒pEGFP-C2 /βig-h3。重组质粒用脂质体转染人7721肝癌细胞，明胶酶谱法检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。结果：正确构建了pEGFP-C2 /βig-h3重组质粒，并且在人7721肝癌细胞达到高转染效率，转染后细胞MMPs表达水平明显升高。结论：成功构建了pEGFP-C2 /βig-h3真核表达质粒，βig-h3促进人7721肝癌细胞分泌MMPs，提示βig-h3与肝癌的侵袭和转移密切相关。

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可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

贾仟涛,徐丽慧,迟晓云,查庆兵,李丰耀,何贤辉

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 5-10.

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目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定，然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示，从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中，只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合，构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％；产物相对分子质量约为34 kD，与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA，构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达，为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。

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表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程菌的高密度培养

钟根深,石炳兴,王海东,蒋中华,吴祖泽

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 11-15.

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采用溶氧反馈的分批培养流加补料的方法高密度培养重组大肠杆菌BL21(DE3)生产重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和培养条件的初步筛选，采用溶氧反馈的流加补料策略，进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺的研究。通过对培养条件的不断优化，重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)里得到了高效表达，菌体密度最终达到115g/L(WCW)以上，可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上，含量约为1.1~1.2g/L。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养，结果表明该工艺能有效的放大，可适用于工业生产。

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斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

李赛男,李朝飞,潘丽晶,吴文碧,庞义

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 16-19.

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用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上，构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39，转化大肠杆菌BL21（DE3），在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。

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共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18的重组鸡痘病毒的构建

刘慧娟,金宁一,马鸣潇,金明兰,张林,李旭,计越,鲁会军,金扩世

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 20-23.

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目的:为获得能有效预防O型口蹄疫病毒的重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定基础。方法：在O型口蹄疫病毒P1-2A基因上游引入Kozak序列，下游通过Linker与细胞因子IL-18联结，获得P1-2A基因与猪IL-18基因融合表达基因盒P1-2A-IL-18，将该表达基因盒克隆至鸡痘病毒中间转移载体pUTAL-3C中，构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-3C- P1-2A-IL-18。通过脂质体转染法，将pUTAL-3C- P1-2A-IL-18与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过BrdU三次加压筛选，挑选出单克隆重组病毒株。结果：经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定，证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-IL-18基因盒。结论：成功获得了一株共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘毒疫苗候选株rFPV-3C-P1-2A-IL-18。

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NDV F48E9株与La Sota株F蛋白B细胞表位差异分析区段的鉴定和免疫原性比较

张海玲,刘培欣

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 24-31.

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本文对预测的NDV F48E9强毒株和La Sota 疫苗株F蛋白优势表位进行比较分析。根据预测结果设计克隆了两个毒株F蛋白各4段表位区，分别将每个毒株的4段表位区连接到原核表达载体上进行了体外表达，鉴定得到4段多肽的大小分别是P1：8.0KD、P2:10.8KD、P5:13.5KD、P6:10.5KD。应用F48E9和LaSota特异性抗血清对表达各肽段进行了抗原性鉴定，P1、P2、P5、P6段均呈阳性反应，表明其中含有线性B细胞表位。其中F48E9 P5 (FP5)和La Sota P5(LP5)与血清反应时有明显差异。FP5和LP5与鸡IL-18成熟肽（m ChIL-18）蛋白以不同组合免疫SPF鸡，ELISA检测各组的免疫活性，结果发现FP5与m ChIL-18蛋白联合免疫组的抗体水平高于LP5与m ChIL-18蛋白联合免疫组、FP5、LP5单独免疫组；用NDV F48E9株攻毒结果显示FP5具有20%的保护率，说明P5段与F蛋白免疫原性相关，而LaSota P5不能抵抗强毒的攻击，证明该表位区域在两个毒株之间存在着免疫原性差异。

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抗P185工程抗体表达与纯化的研究

乔婧娟,刘海波,朱娟娟,程联胜,刘兢

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 32-37.

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人类的原癌基因Her-2编码一个185kDa的跨膜受体酪氨酸激酶，也称为p185，是肿瘤相关蛋白，在多种癌细胞，特别乳腺癌中有高表达。本实验室构建了抗p185/HER-2的二价的嵌合抗体（scFv-Fc），并证明其保留了亲本抗体的特异结合活性，进而建立了高表达的细胞株。本研究对该嵌合抗体进行滚瓶大规模培养，并对培养产物的纯化条件进行了摸索，建立了亲和层析和阳离子交换层析两步法。最终产物的纯度达到95％以上，回收率为63％。我们还摸索了嵌合抗体的冻干保存条件，抗体可以保持其稳定性和结合活性达一年以上。嵌合抗体纯化工艺和保存条件的确定，为进一步的临床研究奠定了基础。

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在海藻酸钠凝胶上诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

王嫣,陈小菊,王兰,左国伟,寇小琴,谭启华,周兰,陈文直

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 38-42.

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通过在海藻酸钠凝胶上诱导bMSCs向成骨细胞分化，探讨其对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, bMSCs）的生物学效应。采用MTT、甲苯胺蓝染色、von Kossa染色和RT-PCR分别检测细胞的增殖、生长形态、诱导后细胞的钙化结节和成骨相关基因的表达。实验组bMSCs生长状况良好、细胞增殖迅速，与对照组的增殖无差异；bMSCs成集落样生长明显，集落中央细胞重叠生长形成钙化结节；培养至12d，实验组和对照组的成骨相关基因，包括碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素，均为阳性表达，但实验组的表达量高于对照组。海藻酸钠凝胶能够促进bMSCs向成骨细胞的分化，是良好的骨组织工程支架材料。

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聚乙二醇对羟基丁酸和羟基己酸共聚物的共混改性研究

邹冰,曲向华,梁娟,陈国强,吴琼

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 43-50.

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本研究以聚羟基脂肪酸酯家族中的新成员羟基丁酸和羟基己酸共聚物（PHBHHx）为基础，采用与聚乙二醇（PEG）共混的方法对其进行改性，研究结果证实：PHBHHx与PEG 共混物中比例为3:1及2:1时，两者完全物理相容。而PEG在共混物中比例升高时则导致相分离，成为部分相容体系。PEG掺入显著提高材料亲水性及表面自由能，使血管平滑肌细胞（RaSMCs）及血管内皮细胞（HUVECs）的细胞粘附及增殖大幅度提高，并且均具有一定的PEG含量依赖性。其中对RaSMCs的作用最为明显，RaSMCs能在PEG/PHBHHx比例为1:1的共混膜（E1X1）上持续增殖至融合，而HUVECs则呈粘附较差的类球形形貌，证实E1X1可以潜在应用于复合血管组织工程支架中的近内膜基材。

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鸡传染性贫血病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

陆桂丽,高玉龙,高宏雷,冉多良,王笑梅

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 51-55.

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以原核表达的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，三次免疫后，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，融合阳性细胞用间接ELISA方法检测，阳性细胞株经三代克隆纯化后，获得三株能稳定分泌抗CIAV VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为AG2、BC11、FG1。三株杂交瘤细胞株产生的细胞培养液上清和小鼠腹水的ELISA效价分别为2.5ⅹ102、1.5ⅹ102、1ⅹ102和2ⅹ106、1ⅹ106、2.5ⅹ105。与其它禽类病毒的交叉实验表明：这三株单抗具有良好的抗CIAV VP3蛋白特异性。该特异性单克隆抗体的研制成功为进一步研究VP3的生物学特性打下了基础。

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洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）CF-66发酵生产新型抗菌物质CF66I培养基的优化

曾勇峰,权春善

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 56-60.

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利用基于统计学的实验设计RSM（Response surface methodology）优化了Burkholderia cepacia CF-66产新型抗菌活性物质CF66I的发酵培养基组成。首先，用部分重复因子实验对培养基组分NH4Cl，MgSO4·7H2O，柠檬酸钠及酵母粉浓度对菌株产CF66I的影响进行评价,找出主要影响因子为柠檬酸钠和酵母粉。两者均为正影响,其他组分对CF66I活性的影响不显著。其次用最陡爬坡路径逼近最大响应区域。最后用中心组合设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。菌株在优化培养基中培养较初始培养基CF66I活性提高了约两倍。

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二维电泳分离牛精子蛋白的技术研究

王振玲,王栋,朱化彬,程金华,李玉冰,郝海生,杜卫华,沙里金

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 61-66.

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二维电泳是蛋白质分离技术并可由于对精子蛋白的分离。本研究旨在通过对双向电泳条件的研究摸索出一种适用于分离牛精子蛋白的二维电泳技术，并利用其对牛精子蛋白进行分离鉴定。在实验中，优化了等电聚焦程序，研究了精子蛋白的不同制备方法、不同上样量、不同胶条长度对电泳结果的影响。结果表明，采用尿素－盐酸胍两步裂解法裂解精子细胞制备蛋白，使用13cm非线性胶条进行蛋白二维电泳，能获得较好的电泳图谱。图谱经二维电泳软件分析，可检测出约800多个蛋白质点，分子量基本分布在10~100KD、等电点约为4~9的区域内。对精子蛋白二维电泳条件的摸索，为后续牛精子X、Y差异蛋白的检测和分析奠定了理论基础。

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产邻苯二酚工程菌的构建及发酵条件的优化

张宗武,梁璇,张敏,李俊芳,武波

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 67-71.

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从实验室保存的一株能高效降解苯胺的不动杆菌中克隆到完整的苯胺双加氧酶基因簇，序列分析表明该基因簇包含6个完整的ORF，全序列与已报道的不动杆菌YAA的苯胺双加氧酶基因簇在氨基酸水平上有较高的同源性。将该基因簇连接于pLAFR6载体，电转化至E.coli，构建了该基因簇的工程菌。发酵条件优化表明，在苯胺浓度0.5mg/mL，采用pH7.0的LB培养基，E. Coli DH5α为宿主菌，于37℃培养，接种量为3％的条件下，邻苯二酚产量在20h达到0.546mg/mL，底物分子水平转化率可达92.4％。

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表面活性剂对中性粒细胞的影响

罗舜菁,刘成梅,邱声艳,黄丽,陈臣

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 72-75.

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本文探讨了一种新的筛选血细胞作用试剂的方法。中性粒细胞经分离纯化后，表面活性剂对其作用效果可避免受到其他血细胞的影响，能准确反应表面活性剂的作用效果。此方法是筛选血细胞作用试剂的理想方法。

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环境微生物不依赖于培养的基因组学研究及应用

王凤超,刘巍峰,刘春朝,陈冠军

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 76-83.

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微生物在生物圈中分布广泛，并且在地球物质循环中占有重要地位，但是约99﹪的微生物目前还不能通过传统的培养方法得到纯培养物（即未培养微生物），给这些未培养微生物的研究带来很大的困难。随着分子生物学的快速发展及其在微生物研究中的广泛运用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科--环境基因组学的产生和发展。在不进行相关微生物培养分离的情况下，通过从环境样品中直接提取获得所有微小生物的全部遗传物质，并构建环境基因组文库；进一步利用功能基因组学研究策略，从文库中寻找编码产生新的有生物活性产物的基因；通过对系统发育相关锚定位点基因序列分析，从而确定特定生态环境体系中未培养微生物的种类结构组成及进化地位，并最终重建该体系中微生物群体的基本物质循环模式。此外，环境基因组学也可以在对未培养微生物生理生化特性深入了解的基础上，建立发展合适的培养体系，最终获得某些特定微生物的纯培养物。本文对环境基因组的构建及相关分析研究策略的进展进行了综述；同时介绍了其在微生物分类及生态学研究的应用。

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干扰RNA（RNAi）作用机理及其在植物细胞工程中的应用进展

吴大利,侯岁稳

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 84-90.

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随着RNAi调控目的基因表达机理的逐渐深入研究，RNAi技术也发展为一种强有力的实验工具，用来控制目的基因的表达以获取预期的生物表型。目前在植物中至少发现存在三种不同的RNAi途径，这些途径中基因沉默信号可以放大、传递和自我调控。为了建立高效、经济的RNAi技术体系，必须解决以下几个问题：即RNAi的有效传递，稳定性的提高，非目标效应出现的减小以及目标RNA敏感位点的确定等。本文综述了RNAi作用机制以及其在植物细胞工程中的最新应用进展，并详细探讨了其技术体系。

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嗜酸硫氧化细菌消解元素硫的研究进展

夏金兰,张成桂,彭安安,何环,邱冠周

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 91-95.

摘要 ( )

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浸矿酸性环境下，金属硫化矿在Fe3+作用下，经过硫代硫酸盐途径或多聚硫化氢途径而分解的过程中导致大量元素硫的累积，进而可能在金属硫化矿表面形成疏水元素硫层，阻碍金属离子的进一步浸出。酸性环境下，惰性元素硫的消解必须借助嗜酸硫氧化细菌来实现。该消解过程包括嗜酸硫氧化细菌对元素硫的吸附、转运以及氧化转化等过程。本文对近年来嗜酸硫氧化细菌消解元素硫过程的相关研究进行了全面评述，认为有关嗜酸硫氧化细菌消解元素硫的分子机制的清晰阐述还有待人们通过对消解过程的各个环节的分子机制进行大量研究来实现。

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花生子叶生物反应器-花生产业中一支潜在的新生力量

严海燕

中国生物工程杂志. 2006, 26(09): 96.

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花生子叶生物反应器具有产品部位特异、高浓度、可直接食用等优点，本文介绍了这个领域的研究现状和前景，概要介绍了花生生物反应器需要的技术。花生生物反应器的关键是转基因载体的构建。花生主要贮藏蛋白的启动子是构建这种载体的最佳选择。大豆的Glycinin基因启动子也可用于构建花生生物反应器的转基因载体。以上介绍为这一领域的基因工程提供参考。

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2006年, 第26卷, 第09期　
刊出日期：2006-09-25

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