2006年, 第26卷, 第07期　
刊出日期：2006-07-25

  

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研究报告
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  Armillariella tabescens EJLY2098β-甘露聚糖酶的诱导、纯化及酶学性质分析

  姚冬生,黄小葵,刘大岭,谢春芳,胡熔

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 0-0.

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  Armillariella tabescens EJLY2098经魔芋精粉诱导，可产β-甘露聚糖酶，再用正交实验优化诱导培养基，结果在培养基为魔芋精粉2％、蛋白胨1％、土豆汁25％、KH2PO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.15％、维生素B1 0.01％时可诱导出较高活性的酶。用DEAE－阴离子交换色谱从培养上清分离纯化β-甘露聚糖酶，出现2个活性组份。 活性组份P2 的SDS-PAGE分析，发现为电泳纯的一条带，分子量约78.9kD。 HPTLC分析， P2为内切β-甘露聚糖酶；酶反应的最适温度为60℃，最适pH 为4.0～6.0。保温30min的半失活温度t1/2为63℃，在pH 4.5～6.0之间稳定性较好。Na+和Ba2+对其有激活作用，等电点pI约为4.0～4.1。本研究获得了一株产β-甘露聚糖酶的新菌种，为进一步用基因工程方法克隆并构建具有完整自主知识产权的重组β-甘露聚糖酶基因工程菌提供了一个重要的基础工作。
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  含Arg9的人抗HBsAg单链抗体/ EGFP融合蛋白基因的构建、表达和内化作用的研究

  薛茜,温伟红,孟艳玲,薛采芳,张勇,张巍,王涛,贾林涛,杨安钢

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 1-6.

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  目的：构建、表达和纯化带有转膜结构域Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白， 并对纯化产物的亲和 活性和内化作用进行研究。 方法： 将Arg9的编码序列分别重组到ScFv14/EGFP基因的5'端或3'端或二者之间，将它们分别克隆入原核表达载体pET32a，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS进行诱导表达和纯化，用间接ELISA方法检测表达产物与HBsAg的亲和活性，并用间接免疫荧光检测纯化蛋白的内化活性。 结果：经测序及酶切鉴定证实四种融合基因序列完全正确.SDS-PAGE和Western blot证实四种融合基因成功表达和纯化.间接ELISA检测证实四种融合蛋白均具有HBsAg结合活性，间接免疫荧光检测显示N端带有Arg9的融合蛋白有较强的内化作用，而且不内化进入HBsAg非表达的细胞。 结论：成功构建、表达和纯化了ScFv14/EGFP融合蛋白和三种带有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白，纯化产物均具有与抗原HBsAg亲和的活性，N端带有Arg9的融合蛋白与靶细胞作用有较强的内化作用。
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  胎膜组织贴壁细胞：一种新的间质干细胞来源

  马志成,龙志高,邬玲仟,潘乾,梁德生,戴和平,夏昆,夏家辉

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 7-12.

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  [目的] 建立体外分离纯化胎膜组织贴壁细胞（fetal membrane derived adherent cells，FMDACs）的方法，并且研究FMDACs的基本生物学特性。[方法] 用胰酶消化法分离FMDACs，体外传代培养，并进行向成骨、成脂细胞的诱导分化培养，流式细胞仪、免疫细胞化学检测表面抗原，核型分析及致瘤性实验。[结果] 成功地进行了FMDACs的原代培养及传代培养，FMDACs具有良好的增殖能力，表达CD44、CD29,不表达CD34、CD14、CD45,经诱导后能够分化为成骨细胞和成脂细胞，传代多次后核型正常,无致瘤性。[结论] 胎膜组织中可以分离得到具有间质干细胞特性的贴壁细胞，具有较强的自我更新和多向分化能力，遗传背景稳定无致瘤性。FMDACs为临床应用进行细胞治疗和基因治疗提供了新的来源。
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  人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

  雷楗勇,张莲芬,杨健良,金坚

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 13-18.

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  利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因，将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中，置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下，分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化，电击转化毕赤酵母KM71，经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后，用甲醇诱导表达，SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性；用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。
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  奥利亚罗非鱼DMO和DMT蛋白二级结构和B细胞抗原表位的预测

  曹谨玲,陈剑杰,俞菊华,吴婷婷

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 19-24.

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  以DMO和DMT氨基酸序列为基础，采用Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测蛋白质的二级结构；按Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法预测DMO和DMT蛋白的B细胞抗原表位。预测结果表明：在DMO蛋白N-端第80～112，144～147，193～194，251～255，260～269区段和279～283区段，DMT蛋白N－端61～86，98～105，140～146，239～241区段和第269～273区段，可能是α-螺旋中心；DMO蛋白N-端第59～61，69～70，148～150区段和383～390区段，DMT蛋白的N-端第125～129，207～213，255～264区段和第281～284区段，可能是β-折叠中心；在DMO蛋白分子N-端40～41， 44～45，50～51，128～129，189～192，204～207，216～222，226～233，244～246，298～299区段和第323～326区段和DMT蛋白分子N-端第12～13，26～27，43～44，58～60，93～95，115～120，136～139区段和第149～151区段具有较柔软的结构，这些区段有可能进行一定幅度的摆动或折叠而形成较复杂的三级结构。DMO蛋白N-端第1～5，41～51，65～67，86～89，98～110，154～170，183～203，205～248，258～264，284～291，293～298，270～375，389～392，402～410区域和DMT蛋白N-端第1～9，17～28，77～84，114～123，131～139，157～184，196～207区域可能是B细胞表位优势区域。以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段，用抗原指数，亲水性参数和可及性参数预测DMO和DMT蛋白的B细胞表位，为DMO和DMT蛋白单克隆抗体的制备提供了线索，为系统研究奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的性别调控机理研究提供参考。
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  拟南芥K+转运蛋白AtKup1基因的DNA改组

  郭兆奎,杨谦,姚泉洪,万秀清,颜培强

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 25-30.

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  采用同源重组法制备钾离子转运蛋白TRK1和TRK2缺失的酿酒酵母钾营养缺陷型，通过RNA 反转录PCR方法从拟南芥幼根扩增获得片段长度为2139bp 的Atkup1基因，以此片段为模板，采用DNA 改组技术,经Dnase I降解,Primerless PCR , PrimerPCR，建立Atkup1 基因突变库。将突变库和未经DNA 重排处理的Atkup1基因分别构建酵母穿梭载体导入K+转运蛋白基因TRK1和TRK2缺失的酿酒酵母中,分别在低钾(5.0mM KCl)不含色氨酸的培养基上筛选转化子, 突变基因库酵母转化子中获得2株长势明显好于Atkup1 基因转化子的突变基因转化菌株，菌株质粒上的突变Atkup1基因核苷酸测序结果发现突变基因Atkup1发生2个碱基的置换，造成2个氨基酸的改变，转化烟草烟叶化学成分分析证实突变基因的吸钾活性显著提高。
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  金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶基因的克隆及高效表达

  任文彬,张世清,黄俊生

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 31-36.

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  几丁质酶是昆虫病原真菌金龟子绿僵菌致病力的主要因子之一。本实验用RT-PCR方法,从本实验室分离筛选到的高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae HN1中，扩增得到几丁质酶基因全长，此基因全长为1275bp，登录号为DQ011865，经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae E6的chi1基因（AF02749）同源率为96% 。以pET-22b(+)为基础载体，构建pET-chi重组表达载体，在大肠杆菌（Escherichia. coli ）BL 21中进行表达。经SDS-PAGE分析，获得了42kDa大小的重组目的蛋白，目的蛋白占表达总蛋白含量的63.3%。菌体经冷冻与超声波破碎后，按DNS法可测得几丁质酶的活性。
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  重组线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达

  姜月华,宋健,王健伟,韩金祥,洪涛

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 37-41.

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  目的：获得具有抗凝活性的重组线虫抗凝肽（NAP）蛋白, 为新型抗凝药物的开发奠定基础。方法：将pPIC3.5K-rNAP质粒转化毕赤酵母菌株GS115，筛选出阳性菌株后，用甲醇诱导表达。收集酵母培养上清，用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物，通过测定PT(血浆凝血酶原时间)、INR（血浆凝血酶原国际标准化比率）和APTT（活化部分凝血活酶时间）来验证其生物学活性。结果：获得了稳定表达NAP的重组酵母菌株。重组NAP被分泌表达，其分子量比预计分子量（8.7KD）稍大，约为10KD左右，可能与糖基化有关。体外活性检测证实其有较强的抗凝活性。结论：在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的重组线虫抗凝肽，可用于新型抗凝药物的开发。
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  弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

  齐向辉,罗兆飞,韦宇拓,陈发忠,王珊珊,候守海,廖东庆,黄日波

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 42-47.

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  1,3-丙二醇（1,3-propanediol，1,3-PD）是一种重要的化工原料，越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板，通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase，PDOR) 的基因dhaT，序列显示与来源于C.freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pSE380，得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E.coli JM109中进行了表达，重组酶通过镍柱及Sephacral S-300进行纯化，重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8.0，对丙醛的Km值为10.05mmol/L，最大反应速度Vmax为37.27umol/ min /mg；以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10.5，对1,3-PD的Km值为1.28mmol/L，最大反应速度Vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50U/mg，氧化反应比活为79.72U/mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-PD奠定了基础。
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  酿酒酵母突变株J-X25胞内合成GSH的研究

  肖蕴,许激扬,荆宁

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 48-51.

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  以筛选得高产谷胱甘肽(GSH)产生酵母甲硫氨酸缺陷型变株J-X25为试验菌株。对其培养条件进行研究，结果表明：发酵培养基的最适初始pH值为6.0、最佳发酵温度为30℃、最佳装液量为100ml/500ml、接种量10%、摇床转速为220r/min。在酵母细胞培养到对数期，加入过氧化氢刺激细胞发生应激反应和乳酸钠作为表面活性剂改变细胞通透性，GSH总量达到0.253g/L，比不添加两者情况下的GSH产量高出52％。结果表明优化培养条件后，J-X25胞内积累GSH比出发株提高79％。
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  甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

  乔宇,陈小兵,丁宏标,岳明

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 52-56.

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  采用PCR的方法，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板，克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列，将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中，并位于α-因子信号肽序列的下游，获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达1102IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。
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  柔红霉素产生菌SIPI-1482中dnmV基因功能的阻断及恢复

  尚珂,宫倩,胡又佳,朱春宝,朱宝泉

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 64-68.

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  dnmV基因产物为柔红霉素生物合成途径中TDP-6-脱氧己糖C4酮基还原酶，破坏该基因能阻断柔红糖胺的合成，进而阻断柔红霉素的产生。从天蓝淡红链霉菌(S. coeruleorubidus)SIPI-1482基因组DNA中经PCR扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段，并由此构建了用于阻断dnmV基因的同源重组质粒pYG817，转化SIPI-1482菌株后成功地破坏了dnmV基因，发酵结果显示阻断突变株不再代谢产生柔红霉素，为引入新的基因来改变代谢产物的糖基结构打下了基础。通过导入dnmV基因表达质粒可重建该突变株的生物合成途径，恢复产生柔红霉素，但产量比出发菌株要低。
研究简报
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  水牛SRY基因的克隆及序列分析

  付强,张明,卢克焕,秦文松,郑海英

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 69-73.

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  根据荷斯坦牛SRY基因设计一对引物，采用聚合酶链式反应（PCR）技术，以中国沼泽型水牛（Swamp Buffalo）基因组DNA为模板，扩增得到SRY（Sex Deterimation region of Y chromosome）全序列约2005bp，其中1-504bp为5’启动子区，1196-2005bp为3’侧翼序列，在505-1195bp为SRY的外显子，编码229个氨基酸。在SRY HMG box区域设计探针，用地高辛标记后分别与雄性、雌性水牛基因组DNA进行Southern 杂交，结果显示该段序列只在雄性DNA样本中有杂交信号，证明SRY基因为雄性特异。BLAST比对结果显示与牛属动物SRY基因的同源性为96％，其中SRY基因HMG box区域同源性高达99%，说明SRY基因具有高度的进化保守性
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  小鼠-牛体细胞种间核移植

  李煜,梁琳,王振飞,旭日干

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 74-79.

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  本文探讨了小鼠-牛异质胚构建的简便方法及小鼠体细胞核在牛卵母细胞中重新编程的可能性。以牛的卵母细胞为细胞质供体，用去除透明带及徒手切割的方法去核，设定电压1.5 KV/cm，脉冲时间40μsec，与小鼠皮肤成纤维细胞进行电融合的融合率为67.44%，卵裂率为30.23%。融合细胞经离子酶素-6-DMAP激活，用微滴内压制做窝的方法培养小鼠皮肤成纤维细胞异质胚，异质胚的最终发育阶段为8细胞期。结果表明，去透明带牛卵母细胞经切割法去核，可用于小鼠异质胚构建；微滴内做窝的体外培养方法可避免无透明带胚胎的聚合。
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  翅碱蓬CMO基因克隆、测序及植物表达载体的构建

  仲崇斌,刘长江,费腾,袁晓东,孙丽慧

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 80-83.

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  从翅碱蓬叶片中提取总RNA，根据相关同源序列设计引物，使用反转录试剂盒进行RT-PCR，扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶（CMO）cDNA，进行PCR产物测序；然后将CMOcDNAT-A克隆至pMD18-T-simple载体上，经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体，进行酶切鉴定及克隆测序。
综述
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  RNA干扰文库在功能基因组学研究中的发展及应用

  张莹,杨耀武,王健伟,,屈建国,洪涛

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 84-89.

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  RNA干扰（RNAi）是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性转录后基因表达沉默，从基因组水平设计针对多个靶基因的RNAi序列，建立RNAi文库进行系统性、大规模的筛选工作是功能基因组学研究的有力工具。目前RNAi文库主要包括质粒（或病毒）文库、siRNA表达盒文库、寡核苷酸文库和随机RNAi文库，已经被成功应用于基因功能鉴别、信号转导途径解析和药物靶标筛选等研究领域。近年来，这一领域发展迅速，本文就RNAi文库的发展应用以及存在的问题与展望进行综述。
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  真菌聚酮合酶基因分离方法的研究进展

  严少华,郭亮,李燕萍,许杨

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 90-93.

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  真菌聚酮合酶在代谢中可催化合成多种具有重要生物学活性的次级代谢物，所以真菌聚酮合酶正逐渐成为药学、食品科学和农学等领域的研究热点。本文综述了近五年来建立的几种分离真菌聚酮合酶基因的方法。这些方法解决了真菌中聚酮合酶基因簇难以分离的问题，为改造和利用真菌聚酮合酶以及发掘真菌聚酮化合物资源提供了强有力的手段。
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  天然抗感染分子-细菌透性增加蛋白

  马海蓉,孙仪,曹旭,汪汉卿

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 94-98.

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  革兰氏阴性菌细胞外壁中的脂多糖结构即内毒素，经常是引发脓毒症、菌血症等系统性炎症反应的"元凶"。近十余年的研究发现，细菌透性增加蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein，BPI）具有特有的中和内毒素和拮抗革兰氏阴性菌的能力, 是一种抗感染的天然的分子靶。大量的临床研究结果已经显示其用药的有效性和安全性。近几年来国外生物药业公司正努力将重组人BPI推向市场。
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  厌氧发酵法生物制氢的研究现状和发展前景

  卢文玉,刘铭辉,陈宇,闻建平

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 99-104.

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  氢气是一种理想的能源，具有转化率高、可再生和无污染等优点。与传统制氢方法相比，生物制氢技术的能耗低，对环境无害，其中的厌氧发酵生物制氢已经越来越受到人们的重视。本文主要介绍了厌氧发酵生物制氢技术的方法和机理，分析了生物制氢的可行性，结合国内外研究现状提出了未来的发展方向。
论坛
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  海洋生物资源与可持续利用对策研究

  傅秀梅,王长云,王亚楠,鹿守本,管华诗

  中国生物工程杂志. 2006, 26(07): 105-111.

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  着重分析了海洋生物资源状况及其生态环境问题，提出了未来我国海洋生物资源的发展对策。海洋生态环境恶化和不合理的开发利用，使我国海洋生物资源严重衰退。开展海洋生物资源学相关基础研究，重点进行海洋环境与生物资源保护，运用海洋生物技术等高新技术科学、合理地开发利用生物资源，是实现海洋生物资源可持续利用和长久发展的可行策略。