中国生物工程杂志

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赵娟,何冰,江汉民,程秀玮,俞新大

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 1-5.

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从人胎盘组织中提取总DNA，经PCR扩增编码人β神经生长因子（β-NGF）成熟肽的基因，并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，经IPTG诱导表达得到16kD的目的蛋白带，与预期的大小一致，NGF表达量约占全菌总蛋白的25%.经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA his-bind column）纯化后得到了单一的NGF蛋白条带，蛋白纯度可达90%以上，从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western 印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应，在16kD处出现单一的条带，表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明，本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。

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GPI锚固型Met-RANTES真核表达载体的构建和表达

李臻,夏峰,张远强

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 6-11.

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目的：在仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中高效表达糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白，以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型 Met-RANTES。方法：构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES，利用电转化法转染CHO-DHFRˉ细胞，氨甲喋呤（MTX）筛选抗性克隆。用流式细胞仪、细胞免疫荧光和免疫金标记电镜检测细胞膜上 GPI 锚固型Met-RANTES融合蛋白的表达情况。结果：构建了阅读框完整的 GPI 锚固型Met-RANTES 嵌合分子，经测序是正确的，并在CHO-DHFRˉ细胞膜上稳定表达。结论：在CHO 细胞表面高效表达GPI修饰的Met-RANTES融合蛋白，GPI 锚固型Met-RANTES分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中，抑制移植排斥反应。

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Mo MLV gag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定

王传玺,韩金祥,鲁艳芹,宋宝,刘杰

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 12-16.

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目的构建含MoMLV gag-pol基因的重组表达载体，实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因，克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上，构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明, gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kD)为194.78×103。然后，将逆转录病毒载体导入此细胞系，包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果酶切鉴定的片段大小分别为5.2-kb，与预期大小一致，经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株，SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kD)为194.78×103，与预期相符。脂质体转染包装细胞，嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆，且未检测到辅助病毒。结论本工作构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达，构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系，该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒，为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。

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PS1/GFP融合蛋白对PS1的亚细胞定位与功能的初步研究

李铁,李佳慧,宁丽峰,桑建利

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 17-22.

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PS1基因突变与早发家族性老年痴呆有密切联系。本文构建pEGFP-C1-PS1以及pEGFP-N2-PS1融合基因表达载体，于HEK293和CHO细胞系中表达PS1/GFP融合蛋白，以GFP绿色荧光作为PS1的亚细胞定位信号，通过SPOTII以及CONFOCAL显微镜进行观察，初步获得PS1全长蛋白在细胞中定位的部分信息，即本实验条件下，PS1定位于细胞核膜，细胞质内有不均匀的分布，少量存在于细胞-细胞接触处的细胞膜上。

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硒与金属硫蛋白及对小鼠肝损伤的防护作用研究

田晓丽,唐欣,左刚,毛建平,郭军华

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 23-29.

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应用蛋白质芯片和RT-PCR技术研究硒对小鼠肝脏金属硫蛋白（Metallothionein, MT）的诱导表达；以蛋白质芯片技术为主要实验手段研究CCl4诱导的小鼠肝脏损伤后血清及肝脏蛋白质图谱变化，寻找小鼠血清及肝脏组织损伤标志物，同时观察有机硒(麦硒康，Organ-Se)对损伤的防护作用，结果表明与对照组相比给予有机硒后的小鼠肝脏MT表达明显；比较肝损伤组及用药组（Organ-Se）组的血清及组织蛋白质表达图谱变化，发现血清中存在3个具有统计学意义的标志物：5062.5Da 、5566.5Da、6358.5Da；肝脏组织中有4个具有统计学意义的标志物：5449.6Da、7131.5Da、9903.2Da和10767.3Da；与损伤组相比预先保护组（Organ-Se）的血清及肝脏标志物的表达水平接近正常组。本实验表明非金属元素硒，尤其是有机硒同金属元素（如锌）一样，能够有效诱导MT的表达，为今后进一步开展硒代金属硫蛋白的机制研究奠定了基础；同时在对小鼠肝损伤保护的研究中发现，有机硒具有明显的肝损伤保护作用，是一种较有前途的值得开发的肝损伤防护药。

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人细胞周期蛋白G2基因真核表达载体构建及其功能研究

田玉楼,刘洁,张学

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 30-35.

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构建人cyclin G2基因真核表达载体，进一步研究cyclin G2对体外培养细胞增殖的调节作用及可能的调节机制。以人口腔癌前上皮细胞系POE4总RNA的反转录产物为模板，应用RT-PCR方法克隆cyclin G2基因cDNA，成功构建真核表达载体pIRES -G2；应用脂质体介导的基因转染技术，以体外培养的肿瘤细胞系HeLa细胞和正常细胞系CV-1细胞作为受体细胞，进行转基因表达研究，发现cyclin G2高表达对体外培养细胞的增殖起明显抑制作用；应用p16INK4a、p21WAF1、p27KIP1三种周期蛋白依赖性激酶抑制因子的单克隆抗体对转基因的HeLa细胞进行免疫细胞化学研究，发现转染pIRES-G2的实验组细胞中，p21 WAF1蛋白染色阳性细胞数明显多于转染空载体的对照组，平均光密度值高于对照组，两组间均有显著性差异（p<0.01），提示cyclin G2抑制细胞增殖作用可能是通过诱导p21WAF1的表达而实现。

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脂蟾毒配基诱导人肝癌细胞凋亡作用的研究

肖义秀,张瑾峰,吴白燕

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 36-39.

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目的通过体外脂蟾毒配基对人肝癌细胞（Bel7402）的凋亡诱导作用，为研究其抑制肿瘤细胞生长的作用机制提供依据。方法通过应用流式细胞光度术检测细胞凋亡；采用细胞免疫细胞化学显色检测和Western blotting分析凋亡相关基因蛋白的表达来研究脂蟾毒配基对人肝癌细胞（Bel7402）凋亡的诱导作用。结果表明脂蟾毒配基能够诱导Bel7402细胞发生凋亡，凋亡率大于50%；脂蟾毒配基提取液(浓度1.0 μm）作用于Bel7402细胞24小时后，bc1-2蛋白的表达下调，到48、72小时后下调更明显；而Bax蛋白的表达从24小时后开始上调，到48、72小时后表达上调明显。使用方差分析法与对照组相比较，P<0.05 ，统计学有显著意义。结论提示诱导肿瘤细胞凋亡可能是脂蟾毒配基抑制、杀伤人肝癌细胞的机制之一。

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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因在昆虫细胞中的表达

刘春国,刘明,张云,杨涛

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 40-44.

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将H5N1亚型禽流感病毒（AIV）NS1基因插入到杆状病毒转移载体pFastBac1中，获得重组转移载体pFastBac1- NS1。将pFastBac1- NS1转化到DH10Bac感受态细胞中，筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体转染试剂介导下将rBacmid-NS1转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后，通过SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析表明：获得了分子量为26ku的特异性NS1蛋白；并且该蛋白可与H5N1 AIV攻毒鸭的血清发生特异性免疫反应，而不能与H5N1AIV灭活疫苗免疫鸭的血清发生反应。试验结果表明：NS1在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达，具有与天然蛋白相似的免疫活性，并可以作为区分免疫及自然感染个体的鉴别诊断抗原。本实验为建立禽流感病毒自然感染家禽与禽流感灭活苗免疫家禽的鉴别诊断方法奠定基础。

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外源基因转染导致山羊体细胞过快衰老与端粒缩短

李兰,潘庆玉,沈伟,潘庆杰,周艳荣,邓继先

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 45-49.

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在对山羊体细胞进行外源基因转染过程中，无论电击法或脂质体法所得到的细胞克隆都有细胞过快衰老的现象。山羊体细胞转基因后出现细胞体积增大、细胞核膨大并逐步分裂成多核、细胞质空泡化和吐核等衰老的表型特征。转基因后衰老细胞的染色体核型正常，但经细胞染色体端粒长度的Southern检测发现，转基因衰老细胞比原代胎儿成纤维细胞染色体端粒长度减少了2.56 kb，超出了正常传代40代的细胞的衰老速度，但转基因衰老细胞仍能支持核移植克隆胚胎的早期发育。

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产藏红花素栀子愈伤组织的诱导和筛选

陈书安,王晓东,赵兵

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 50-54.

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为解决藏红花资源问题，研究了栀子愈伤组织的诱导，并首次应用目视法和HPLC 方法对产藏红花素细胞系进行了筛选。结果表明栀子叶子愈伤组织优化的诱导条件为: 在添加1mg/L 2,4-D和 0.25 mg/L 6-BA的MS 培养基上， 25±1℃和31.74 mmol/m2s光照强度下每天光照16小时，培养15d后可获得100%的诱导率。种子愈伤组织也易诱导，在添加0.5mg/L 2,4-D 和 0.25 mg/L 6-BA的MS培养基上，25±1℃全时暗培养15d后可获得100%的诱导率。首次应用建立的目视法和HPLC 方法, 从90株细胞系中筛选出细胞系seed4，其藏红花素1 的含量是0.348mg/g，生长较快、不易褐化，兼顾了此次生代谢产物的含量和细胞的生长速度，为采用植物细胞工程法解决藏红花素资源短缺问题提供了种质资源。

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兔早期胚胎发育相关新基因IFRG的克隆和表达

齐冰,何新,徐来祥,陈清轩

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 55-58.

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近来的研究表明干扰素在哺乳动物早期胚胎发育中有重要的作用。我们首次克隆了兔早期胚胎发育相关新基因IFRG（干扰素应答基因）的全长cDNA序列（AJ584672），根据该cDNA序列以兔卵巢cDNA为模板经PCR扩增后克隆了兔IFRG cDNA的完整开放阅读框(396bp)。将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，在大肠杆菌BL21中进行了GST-IFRG融合蛋白的表达。经IPTG诱导培养后，SDS-PAGE电泳检测结果显示在41kDa处有特异性表达蛋白，回收融合蛋白作为抗原免疫小鼠，制备多克隆抗体，通过Western杂交表明该融合蛋白具有生物免疫活性。

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产1,3-丙二醇菌株的诱变和筛选

王宝光,刘铭,杜晨宇,黄志华,沈金玉,曹竹安

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 59-64.

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为提高克雷伯氏肺炎杆菌产1,3-丙二醇的能力，以离子束、紫外线和氯化锂为复合诱变法，建立了产酸圈和产物耐受相结合的平板筛选方法，获得可耐受高浓度1,3-丙二醇并且副产物中乙醇含量较少的优良突变菌株2株。与出发菌株相比，两株高产突变菌株Klebsiella pneumoniae LM 03和Klebsiella pneumoniae LM05的1,3-丙二醇产量分别提高了33% 和30% ，达到66.74 g/L和65.12 g/L；乙醇产量分别降低了38% 和24% ，降低为6.59 g/L和8.05 g/L。同时测定了诱变前后还原途径中甘油脱水酶（GDHt）和1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）的酶活变化，研究表明诱变对GDHt有明显的促进作用，而对PDOR的影响不明显。该诱变和筛选方法目标明确、易操作、效率高，在1,3-PD工业规模的生物法生产中将具有良好的应用价值，而且对于其他具有工业应用价值的菌株筛选工作也具有一定的借鉴意义。

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一种基于荧光强度分析的高通量定量检测细胞凋亡方法

叶玲玲,刘红,刘兴茂,李世崇,吴本传,王启伟,陈昭烈

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 65-70.

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根据正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性，用4μmol/L YO-PRO-1（YP）和4μg/ml 碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色96孔板中的细胞样品。分别在485/538 (Ex/Em, nm) 和530/590 (Ex/Em, nm) 的检测波长下借助荧光分光光度计检测细胞样品孔的YP和PI荧光强度。将YP和PI荧光强度值与用荧光显微镜对同一细胞样品细胞凋亡和坏死的定量分析结果相对应，通过对YP荧光强度值与凋亡细胞数的直线回归分析 (r = 0.999，P<0.01)，得到依据YP荧光强度值求得凋亡细胞数的直线相关方程。该方法可检测出样品中少至180个的凋亡细胞，具有灵敏度高和快速高效的特点。

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一种改进的双向电泳染色方法

王欣荣,刘锋,刘建华,韩泽广

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 71-74.

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本文涉及了双向电泳过程中的染色方法，即先用考马斯亮蓝染色，将胶上可见蛋白切下再银染的方法。这种方法可最大限度的减少胶中蛋白质点的损失，不仅避免了单一用考马斯亮蓝染色由于灵敏度不高而导致的低丰度蛋白的损失，也避免了单一用银染而使高丰度的蛋白因染色过度导致的损失。同时两种传统的染色方法结合完美，形成的新方法经济实用。

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抗体在二氧化硅表面固定及活性测定

刘康栋,赵辉,金庆辉,赵建龙

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 75-77.

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应用分子自组装技术，通过表面羟基化、氨基硅烷化和对苯二甲醛组装，在二氧化硅表面衍生活泼的醛基基团。利用抗体的氨基和醛基发生还原胺化反应将抗体固定在二氧化硅表面，通过抗原抗体反应定性检测固定抗体的生物活性。结果显示应用这种方法能够有效将抗体固定在二氧化硅表面，并保持抗体生物活性，该固定方法在蛋白质检测、分析和蛋白质芯片中有广泛应用价值。

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以BAC为基础的疱疹病毒感染性克隆技术

卢建红,唐运莲,李桂源

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 78-82.

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疱疹病毒（HPVs）庞大而复杂的基因组一直使得HPVs的遗传分析颇具挑战性。近几年发展起来的以细菌人工染色体（BAC）为基础的HPVs全长感染性克隆是全新的技术，促进了在HPVs整个基因组中对单个基因功能的研究。本文以EB病毒为例，介绍了该技术的原理、建立、突变方法及应用。

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脐带血来源干细胞神经分化的研究进展

李云涛,李桥川,邱录贵

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 83-87.

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中枢神经系统损伤后的自身修复能力有限，因而研究者致力于寻找一种合适的细胞进行移植以代替受损的神经细胞修复神经损伤。近年来的研究表明，脐带血干细胞能够在体外诱导条件下向神经样细胞分化，并在动物体内实验中促进神经损伤的恢复，有可能作为一种有效的细胞资源，应用于人类中枢神经系统疾病的细胞替代治疗以及神经保护与支持。

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林木蛋白质组学研究进展

袁坤,王明庥,黄敏仁

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 88-92.

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近年来，应用新的基因组学技术来研究林木生长发育以及林木对生物与非生物胁迫的反应已使得人们对林木生物学有了相当大的了解。蛋白质组学是林木生物学的重要内容。本文综述了林木蛋白质组学在群体遗传、遗传作图、逆境生理、组织器官以及木材形成等方面的研究进展，并简要介绍了林木蛋白质组数据库。最后展望了林木蛋白质组学的发展前景。

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发展菜籽油制备生物柴油产业的一种有效对策

陈锦清,吴关庭

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 93-98.

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菜籽油是生产生物柴油的主要原料之一，目前用菜籽油生产生物柴油的主要瓶颈是原料成本较高，一般占到总生产成本的75%左右。在介绍国内外菜籽油制备生物柴油产业发展现状和存在的主要问题的基础上，提出了利用现有冬闲田生产高芥酸油菜籽，以高芥酸菜籽油为原料联产制备生物柴油、芥酸及其系列衍生产品和甘油、甾醇类化合物等高值副产品对策，并从产品用途与市场需求潜力、企业经济效益、生产技术和条件、原料来源等几方面分析了这一发展对策的可行性。该对策的实施，将实现我国菜籽油制备生物柴油产业的兴起和可持续发展，提高生物柴油产品品质，带动我国生物化工和其它诸多行业的共同发展，为我国社会主义新农村建设作出贡献。

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北京生物技术产业发展研究

曹巍,雷二庆,王磊,雷霆,吴乐山

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 99-102.

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生物技术及其相关产业是北京重点发展的高新技术领域之一。"九五"以来北京在该领域取得了稳步发展。北京在该领域具有研发、人才和临床优势。本文概述了近年来北京生物技术领域在研究、产业、政策等领域的发展现状，提出了目前北京该领域发展面临的主要问题，并以此为基础为北京市该领域未来发展提出了相关建议。

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我国生物医药企业发展建议

刘伟,李朝

中国生物工程杂志. 2006, 26(06): 103-107.

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近年来，国内外生物医药产业发展迅速，在发达国家，哺乳动物细胞表达的产品已经占据了主流地位。我国生物医药企业目前开发的品种主要使用简单的大肠杆菌、酵母表达技术平台，而使用技术难度较高的哺乳动物细胞平台的药品与国外差距较为显著。哺乳动物表达的品种将是国内生物医药企业发展的重要机会。国内生物医药企业只有制定合理的发展战略规划，建立高效的研发平台，选择合适的开发项目，才能推动企业走上发展的良性循环。

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2006年, 第26卷, 第06期　
刊出日期：2006-06-25

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