中国生物工程杂志

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重组抗HER2 ScFv/tBid 基因的表达对SGC7901胃癌细胞的促凋亡作用

王芳,王立锋,裘秀春,许彦鸣,鲍炜,孟艳玲,王成济,范清宇,杨安钢

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 1-6.

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目的：构建重组抗HER2 ScFv/tBid载体并观察其对胃癌SGC7901细胞的促凋亡作用。方法：将重组抗HER2 ScFv/tBid基因克隆入真核表达载体pCMV中，转染SGC7901细胞，用RT-PCR方法检测目的基因在mRNA水平的表达，间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，通过细胞计数检测转染目的基因后对细胞生长的影响，通过检测细胞周期来观察其促凋亡作用。结果：转染SGC7901细胞后，检测出目的蛋白的表达。细胞计数发现细胞的增殖被明显抑制。细胞周期分析有明显的凋亡峰出现，说明重组抗HER2 ScFv/tBid表达后有促凋亡作用。结论：重组抗HER2 ScFv/tBid基因可以在转染的SGC7901细胞中表达，并且可抑制转染细胞的生长，诱导细胞发生凋亡。

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轮状病毒不同基因型NSP4的免疫原性研究

王大燕,王健伟,魏强,王彦斌,屈建国,洪涛

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 7-11.

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NSP4作为轮状病毒的致泻相关蛋白，其在疫苗研究中的作用近年来深受瞩目。为比较不同基因型非结构蛋白NSP4的免疫原性，我们构建了四种基因型的重组表达质粒pCI-97B6、pCI-97S36、pCI-97S34和pCI-97SZ8，在细胞水平进行瞬时表达检测后，进一步免疫小鼠，检测血清IgG抗体滴度和亚型。结果表明利用真核表达质粒表达的NSP4蛋白既可以诱导体液免疫反应，又可以诱导细胞免疫反应，但以体液免疫为主，不同基因型NSP4可具有不同的免疫原性。

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营养补偿和代谢控制提高连续灌注培养重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc的蛋白产率

赵阳,王征,吴芳,陆蓓,史文磊,谭靖伟,马文骏,李纲,陆敏,翁洁,吴劲松,王罗春,刘彦君

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 12-19.

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为解决连续灌注培养产物因营养物质不能有效利用而导致产率偏低的问题，降低生产成本，我们通过在发酵过程中测定表达重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc（TNFRp75:Fc）蛋白的CHO工程细胞株对氨基酸成分的不同消耗速率，定量添加特定氨基酸作为营养补偿，提高了培养基中氨基酸的综合利用效率；同时，在连续灌注过程中通过对葡萄糖补加的限量控制，使培养体系中葡萄糖始终低于0.5 g/L，减少了乳酸蓄积对细胞的毒性作用，从而有效降低了灌注速率。结果显示，在30L工作体积发酵规模上经过氨基酸补偿和葡萄糖控制的连续灌注培养工艺使最终重组蛋白产率（mg/L）和最终产量较工艺改进前提高了2.1倍和3.7倍，分别达到388mg/L和244.4g，生产周期延长了一周。工艺改进前后重组蛋白的唾液酸含量和体外生物比活没有改变。通过营养补偿和代谢控制工艺策略可以有效提高连续灌注培养工艺重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc蛋白的产率和产能，从而降低产业化成本。

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Fas基因mRNA反义靶点筛选和体外验证

,左刚,韩慧明,田晓丽,王全会,毛建平

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 20-26.

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应用PARASS(poly-A anchored RNA accessible sites screening) 技术筛选Fas基因mRNA 获得3个潜在反义作用靶点，靶点1、2、3分别位于Fas基因297nt-317nt、619nt-639nt和662nt-682nt。设计了对应靶点的反义寡核苷酸A1、A2、A3，和10-23型DNAzyme D1、D2和D3。将反义寡核苷酸和Fas基因RNA结合再加入RNase H进行反应，10-23型DNAzyme则直接与Fas基因RNA作用，结果表明：3个靶点的反义寡核苷酸组及DNAzyme均能降解Fas基因RNA，为有效靶点，其靶点反应优势次序为靶点3>靶点1>靶点2；而非靶点对照组和有效靶点突变了2个碱基的对照组均没有反应。靶点2和靶点3与ISIS公司经过多次实验筛选到的Fas反义作用靶点位置基本相同，表明PARASS技术的有效性和可靠性。获得的有效反义寡核苷酸和DNAzyme为后续研究打下基础。

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重组凝血酶敏感蛋白-1N端片段对CD36表达阴性的ECV304细胞增殖的抑制

王黎芳,周毓玲,顾洁,韩忠朝

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 27-31.

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目的：构建凝血酶敏感蛋白-1N端片段（TSF）的原核表达体系，测定重组蛋白的活性。方法：从人脐静脉内皮细胞cDNA中扩增得到thbs1基因片段，克隆到pET32c(+)载体系统并转化BL21大肠杆菌，表达纯化得到TSF。MTT法体外测定目的蛋白对ECV304细胞增殖的抑制作用。免疫荧光标记流式细胞仪测定CD36的表达。结果：获得了原核表达的重组TSF蛋白。目的蛋白对CD36阴性的ECV304细胞有增殖抑制作用。结论：低剂量重组TSF蛋白是一个具有临床应用前景的抗肿瘤治疗的辅助方法。

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人血管内皮抑制素在毕赤酵母中的表达纯化及活性测定

姚雪静,李壮林,常国栋,原桂勇,于学珍

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 32-35.

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血管内皮抑制素是胶原ⅩⅧ C-末端的一个片段，是一个有效的血管生成抑制因子。本文克隆了人血管内皮抑制素的基因，并用毕赤酵母进行表达，表达量为50.5 mg/L。发酵液上清经SP Sepharose Fast Flow凝胶一步层析，产物纯度达到98%以上，纯化收率达到95%以上。毕赤酵母分泌表达的人血管内皮抑制素具有免疫活性；能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生长；并且能特异性地抑制bFGF刺激的人微血管内皮细的迁移，达到抑制效果为50%时所需的蛋白浓度（IC50）为0.4μg/ml。本研究为应用人血管内皮抑制素治疗肿瘤奠定了初步实验基础。

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新型水蛭素嵌合抗栓剂的构建表达与功能研究

牛晋阳,董春娜,靳继德,王立生,吴祖泽

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 36-39.

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水蛭素（Hirudin，HV）作为新一代抗凝剂，它是目前已知最强的天然凝血酶抑制剂，并有望在临床上完全取代肝素。虽然水蛭素有许多优点，但出血倾向是其在临床应用上的主要副作用。目前尚没有好的解决办法。针对水蛭素在临床应用中所出现的这个问题，依据血栓形成的生理生化机制,构建出了含FXa识别序列水蛭素嵌合抗栓剂，来降低水蛭素在非血栓部位的活性从而减小出血的危险。小鼠尾部血栓模型实验表明：此新型嵌合抗栓剂能在不减少水蛭素抗凝血活性的同时，又能大幅度地降低出血副作用。具有非常重要的临床意义。

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球毛壳菌（Chaetomium　globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

,刘志华,杨谦,杨力明

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 40-45.

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以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础，用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp，由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp，编码166个氨基酸，蛋白分子量为17.5kD，理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列，序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中，构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符，说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771，AY584753，AAS66898)。

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人Neuritin在原核表达系统的构建及表达纯化

唐娟,杨磊,吴亮生,于娜,仙玲玲,黄延红,张树军,黄瑾

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 46-50.

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Neuritin是一种新发现能促进神经突起和轴突分支的蛋白，为了更清楚的研究它的生物学功能，我们在已克隆Neuritin cDNA的基础上， PCR扩增出Neuritin ORF，与原核表达载体pET32a重组后，成功的构建了Neuritin原核表达质粒pET32a-Neuritin。重组质粒转化BL21大肠杆菌, IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE 和Western blot证实系Neuritin，用镍离子亲和层析的方法获得了纯化的Neuritin蛋白。

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多重PCR快速确证外源基因在转基因小麦后代的传递

施农农,王慧中,徐莺,何光源,胡斌

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 51-57.

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根据转入小麦0世代中的高分子谷蛋白亚基1Dx5基因和报告基因uidA、作为选择标记的除草剂抗性基因bar的序列，设计合成三对引物。以整合uidA+bar的质粒pAHC25和整合1Dx5的质粒p1Dx5为模板寻找uidA与1Dx5及或bar多重扩增的最佳模板浓度及最适退火温度。MPCR模板量是单对引物扩增时的两倍，引物浓度同常规PCR为0.3μM，uidA与bar的适宜退火温度范围为57.1 - 62.3℃；uidA与1Dx5为60.0℃-60.6℃；uidA、bar、1Dx5的最适合退火温度范围为57.0℃-58.4℃。MPCR对大小相差50bp及以下的多重扩增片段可通过10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在此基础上对14株T1代转基因小麦基因组DNA进行多重PCR扩增，筛选出基因未分离的小麦后代，并与常规PCR比较，结果一致，其中11株同时传递1Dx5和bar基因、1株同时传递uidA、bar和1Dx5基因，3株未检测到外源基因。表明MPCR在快速确证外源基因在转基因植株后代的传递中作用显著。研究在常规PCR反应体系上，对模板浓度和多重引物退火温度进行微调，且把MPCR技术与PAGE技术结合起来，提高了研究结果的准确性，获得了较好的扩增和检测效果，简化了MPCR优化程序，使MPCR的优势更明显，为该技术的广泛应用提供了借鉴。

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重组阿拉伯糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达及其活性分析

姚冬生,谭慧媚,黄辉,刘大岭,谢春芳

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 58-64.

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假密环菌是一种果树腐病菌，具有较强的分解代谢纤维素的能力。本文根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列（Accession Number AJ620046）设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段，构建重组质粒pPIC9-AF，与组氨酸标签融合，电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活，最适反应活性pH值在6.0-8.0之间，而在pH4.0－8.0范围内酶活基本保持在80%以上，比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。本研究工作对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了一个良好的基础。

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重组类人胶原蛋白工程菌补料发酵过程建模

米钰,花秀夫,范代娣,张兮

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 65-69.

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对产类人胶原蛋白的重组大肠杆菌Escherichia coli(E. Coli) 的批式和分批-补料培养动力学进行了研究。通过检测发酵过程的基质浓度、菌体量和产物浓度,建立了一组反映发酵的动力学模型,并考虑了非工程菌存在的影响，分析了细胞生长、底物消耗、基因工程产物生成的过程，结果显示该动力学模型可以很好的拟合发酵过程。

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磁泳分离细菌新方法的研究

刘新星,谢建平,刘文斌,霍强,邱冠周

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 70-74.

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从酸性矿坑水中富集培养分离到的嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans）[1-2] 菌同趋磁细菌具有一定的相似性。通过显微镜观察发现，部分浸矿细菌在外加磁场的作用下具有微弱的趋磁性，基于菌种的这种特性，设计了磁泳分离仪，对其在磁场作用下泳动（磁泳）进行分析，经磁泳后的近磁、远磁菌的生理特性有较大的差异。从用涂布平板法获得的近磁菌纯培养A. ferrooxidans菌体中，分离得到纳米磁性颗粒，能谱分析表明，其主要成分为Fe和O元素。实验结果证明，A. ferrooxidans具有微弱趋磁性，采用磁泳分离该类菌体内含有磁性颗粒的细菌是可行的，这一分离技术的进一步完善和改进将为传统的微生物菌种分离提供一种新型分离技术，也将大大促进趋磁细菌的研究，而且它与浸矿工艺的结合将大大促进我国生物冶金的研究步伐。

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一种快速提取细菌总DNA的方法研究

郑维,权春善,朴永哲,范圣第

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 75-80.

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随着分子生物学技术应用于环境微生物研究的深入开展,占自然界微生物物种总数的90%以上的不能人工培养或培养困难的微生物已经可以借助分子生物学技术进行功能基因的开发和利用。而快速得到纯度较高,结构完整的细菌染色体DNA成为这一技术得以实现的前提。本文报道了利用高温处理和SDS的裂解作用相结合而建立的一种快速、简便的提取细菌染色体DNA的方法。经过脉冲电泳实验证明,利用本方法提取得到的几种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的基因组DNA结构完整,并且无明显降解,无须经过纯化,可以直接进行PCR扩增和酶切等分子生物学操作,将此方法进一步应用于土壤环境DNA的提取方面,同样达到了快速得到大片段、高质量的环境微生物基因组的目的,为研究未培养的环境微生物多样性打下了坚实的基础,同时为环境基因组的提取提供了一个新的途径。

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维生素B12的光解研究及发酵液中维生素B12检测新方法的建立

王雷,张玉明,王云山,张利平,苏志国

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 81-85.

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采用HPLC检测法研究5，脱氧腺苷钴胺素和甲基基钴胺素的水溶液在不同光源及不同照度下的光解情况，结果表明随着光能量的增加光解速度加快。利用脱氧腺苷钴胺素的光解性质，探索了一种检测发酵液中维生素B12含量的新方法。将含有钴胺素的细胞破碎液完全光解后，测定光解后的产物羟基钴胺素，以此来确定维生素B12产量。此方法简便快速、重复性好，可应用于发酵生产维生素B12的各个环节。

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应用载体介导的RNAi技术抑制胰腺癌细胞K-RASAsn12的表达

孟繁杰,付泽娴,张峰,李保东,谢绍建,蔡建辉

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 86-90.

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为了研究载体介导的RNAi（RNA interference）技术特异地抑制K-RASAsn12(K-RAS第12位密码子突变形式为GAT)在胰腺癌细胞中的表达，合成两条编码针对K-RASAsn12突变特异性短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle载体中, 构建含目的基因片段的重组质粒pSC-K-RASAsn12 。同法构建含GFP基因片断的重组质粒pSC-GFP做为对照。用其分别瞬时转染人胰腺癌AsPC-1细胞和BxPC-3细胞后，经半定量RT -PCR和Western Blot检测K-RAS的表达水平。结果表明，构建的针对K-RASAsn12的编码突变特异性shRNA的质粒表达载体可特异的抑制胰腺癌细胞的K-RASAsn12表达，但对野生型的K-RAS（K-RASWT）表达无影响。

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热胁迫下月季叶片蛋白双向电泳分析

,姜蕊,胡永红,蒋昌华,赵宏伟,胡尚连,明凤

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 91-94.

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采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和肽质量指纹谱对耐热性不同月季品种热激处理后进行蛋白质组分析与鉴定。双向电泳后，差异蛋白质点主要集中在分子量10-30 kD、等电点5-6 范围内, 对耐热品种在高温下特异表达的蛋白质点中选取3 个蛋白质点进行肽质量指纹谱的分析, 并检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测, 初步认为这些蛋白质点分别是eIF-5A、LEA蛋白和Hsp17.5。同时本文结合已报道其他植物中这三种蛋白的功能，对月季耐高温生理机制进行初步探讨。

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干扰素系统与病毒的相互作用

徐春娥,陈薇

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 95-100.

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干扰素是最早发现的细胞因子之一，不同类型的IFN生物活性基本相同，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。病毒侵染细胞，诱导细胞产生IFN，IFN通过不同的作用机制启动宿主防御系统，激活酶和作用因子来拮抗病毒的侵染、复制和转录过程。正因为干扰素在抗病毒防御过程中的关键作用，因此病毒已经衍生出了有效的方式能够成功的侵染宿主。病毒通过表达一些拮抗蛋白来干扰IFN的诱导产生、IFN的信号转导或效应蛋白的作用，从而终止干扰素的产生并破坏干扰素诱导的其它因子的作用来逃避干扰素的作用。

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异源器官移植研究进展

周爱东,杨利平,张健

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 101-105.

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本文针对异源器官移植中面临的免疫排斥及病原微生物的感染等主要问题，综述了近年来国内外相关方面的最新研究进展，同时对解决这些难题的方法和技术路线进行了总结，并展望了异源器官移植领域的发展道路。

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从文献统计看我国离子束生物技术的发展

严涛,曾宪贤,李冠

中国生物工程杂志. 2006, 26(04): 106-106.

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本文检索了1994-2003年间离子束技术在生物领域的应用研究文章，并从文献量，研究材料及研究的水平，期刊，离子源和基金来源等五个方面对其进行了统计和分析。统计结果表明，我国离子束生物技术在国家和地方政府院校的支持下得到了较快发展，其中微生物领域的发展最快；进入21世纪，地方政府院校开始逐渐加大对离子束生物技术的支持，并出现了有企业人员参与研究和企业基金支持的文献；文献内容主要是应用研究，基础研究较为匮乏。在综合分析数据的基础上，展望了我国离子束生物技术的未来发展趋势。

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2006年, 第26卷, 第04期　
刊出日期：2006-04-25

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