慢病毒载体不仅能感染造血干细胞 (HSCs) ,使携带的目的基因整合至HSCs基因组内 ,且能利用病毒携带的调控元件 ,使目的基因随HSCs细胞特异性表达 ,因此是一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具。主要对慢病毒载体基因组特点、改建过程、慢病毒对干细胞的感染能力、慢病毒携带的目的基因在HSCs内的表达及调控等方面做了简要的综述
随着转基因技术在各个应用领域的深入和发展 ,转基因沉默现象已引起越来越多人的关注。在介绍转基因沉默的概念、分子机理的基础上 ,着重对提高转基因表达的方法、策略及其研究进展进行综述。分别阐述内含子、组织特异性启动子、增强子、定点整合、DNA大片段、反式作用因子以及基因组调控元件核基质附着区对转基因表达的影响。为克服转基因失活、提高转基因的表达效率提供理论依据。
胃泌素是胃窦和十二指肠黏膜G细胞分泌的多肽类激素 ,主要生理作用是促进胃酸分泌和胃肠道黏膜细胞生长。研究显示胃泌素是胃肠道肿瘤细胞一种自泌性的生长因子 ,通过促进增殖、抑制凋亡、刺激浸润以及和COX-2协同作用促进肿瘤生长。胃肠道肿瘤抗胃泌素治疗途径分为分泌抑制、受体拮抗、反义寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗体治疗。其中抗胃泌素抗体治疗具有诸多优点 ,临床研究进展顺利。
细胞色素P450是广泛存在于动物、植物和微生物体内的一类具有混合功能的血红素氧化酶系。它不但能够催化苯丙烷类、萜类化合物和脂肪酸等内源性物质的生物合成 ,而且参与许多外源性物质包括除草剂等的生物氧化。综述了代谢除草剂的细菌、哺乳动物和植物细胞色素P450酶系 ,概述了细胞色素P450酶系参与除草剂代谢的作用方式 :脱烷基化作用、环甲基化羟基化作用和芳环的羟基化作用等。这些细胞色素P450酶系在培育除草剂抗性作物、生物安全和生物修复方面表现出了巨大的潜能
高等植物在萌发后需要经历一定时间的营养生长 ,即童期 ,才能进入生殖发育阶段。控制植物生殖转变调节童期的基因主要有花序分生组织特异基因、花分生组织特异基因、花器官分生组织特异基因。对近几年木本植物开花调节基因的分离克隆及其童期控制研究进行综述 ,对了解木本植物开花基因的作用功能 ,以及缩短童期和植物进化研究将有所裨益。
益生菌是指能在生物体内存活 ,对生物体的健康有益的一类微生物。目前已经对益生菌的作用机理进行了深入和广泛的研究 ,获得了许多使用益生菌的经验。近些年来 ,分子生物学特别是基因工程技术的发展将益生菌的理论和应用研究推向了一个新的高度。从益生菌菌株的鉴定、菌株的遗传学修饰、益生菌功能基因组学和安全性等几个方面 ,综述了近年来国际上在分子水平上研究益生菌的技术方法、获得的主要研究成果和面临的挑战 ,并提出了益生菌研究的发展方向。
目的 :克隆人白细胞介素 2 9的cDNA ,以进一步研究其结构与功能的关系。方法 :分离人的外周血单个核细胞 ,IMDM(含PHA和IL-2 )培养过夜后 ,Poly(I:C)诱导 2 4～ 48h ,收集细胞 ,Trizol法提取细胞总RNA ,RT-PCR扩增出全长 603bp的IL-2 9cDNA ,将其与表达载体pPROEXTMHTa连接 ,转入大肠杆菌BL21(DE3) ,建立了hIL-29的cDNA克隆。结果 :测序表明克隆的cDNA与Genebank报道的人IL-29cDNA序列完全一致。结论在国内成功获得hIL-29的cDNA克隆 。
目的 :克隆并表达人可溶性增殖诱导配体 (sAPRIL ,即人APRIL105-250) ,为探索其在多种肿瘤细胞的增殖和存活以及促肿瘤形成中的作用奠定基础。方法 :从GENBANK中查找人APRIL蛋白 (编号:07588)序列 ,取其部分胞外 (APRIL105-250)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人APRIL105-250基因 ,测序后将克隆载体经酶切并构建表达载体 ,在大肠杆菌中表达 ,并纯化蛋白。结果 :经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为人APRIL105-250 基因。在大肠杆菌中表达量达 43.6% ,获得纯化蛋白。结论 :成功克隆与表达、纯化了人APRIL105-250基因 ,为深入研究其功能奠定了基础 。
根据猪舒血管肠肽氨基酸序列推导、设计、合成了VIP基因。构建重组表达载体pPICZα-A-VIP。转化Pichiapastoris,在含 100μg/mlZeocin的YEPD平板上筛选。重组子经Ni-NTA介质亲和层析纯化并计算VIP的表达量约为 1.25g/L左右 ,纯化样品通过小分子质量电泳并与VIP标准样品迁移率对照进一步确定了舒血管肠肽已在巴斯德毕赤酵母中得到表达。
在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。
建立稳定高效的动物细胞表达系统对于许多重组蛋白质药物的工业化生产有着十分重大的意义。用PCR扩增得到dhfr基因 ,克隆入载体pIRESneo3基因以替换原有的neor 基因 ,并将hbFGF作为报告基因插入其多克隆位点 ,得到重组子pIRESdhfr hbFGF ,转导CHO细胞后 ,MTX浓度梯度筛选稳定表达hbFGF的细胞株 ,ELISA与WesternBlot检测培养基中hbFGF的分泌表达。结果发现10、100、1000nmol LMTX组均检测到hbFGF的表达 ,其中表达量最高的一株细胞传代20次后表达量仍能维持较高的水平。因此利用双顺反子表达系统可以实现外源基因在动物细胞中的高效稳定表达 。
在E .coliDH5α中表达26肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素2的嵌合体蛋白 ,并进行初步纯化和抗原性检测。利用剪接式重叠延伸 (splicedoverlapextension ,SOE)技术在26肽蜂毒素与基因变构IL-2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽 (Gly4Ser)3,构建嵌合体蛋白的基因,克隆到原核表达载体pGEX4T-2中,重组质粒转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白,纯化蛋白经Thrombin酶切后进行SDS-PAGE与Western-blot鉴定。结果表明重组蛋白有良好的抗原性 。
通过对Bt棉抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠氨肽酶N的克隆和测序 ,鉴定了氨肽酶N基因家族的 1个成员Haapn2 ,其cDNA序列具有 3209个核苷酸 ,含有 3096bp的开放阅读框 ,编码产生1032个氨基酸的蛋白质。其推定氨基酸序列具有锌结合模体HEXXHX18E ,N-末端具有 1 7个氨基酸的疏水性信号序列 ,C-末端还具有 2 2个氨基酸的糖基磷酯酰肌醇 (GPI)添加信号肽。比对抗性和敏感棉铃虫cDNA的开放阅读框 ,抗性品系的开放阅读框中 ,有 5 7个点突变 ,共导致了 1 5个氨基酸的改变 ,其中 2个突变 (谷氨酰胺137→谷氨酸、缬氨酸137→苏氨酸 )位于Cry1A毒素结合区域 ,可能与棉铃虫对转Bt基因棉产生抗性有关。报道的氨肽酶cDNA序列已提交GenBank ,AY346383和AY2 795 35分别是Bt抗性和敏感品系的Haapn2。
猪瘟DNA疫苗制备工艺的建立是其走向产业化 ,从而在猪瘟防制中发挥作用所需解决的关键问题之一。以猪瘟DNA疫苗质粒pVAXE2IL2转化大肠杆菌后 ,转入发酵罐发酵培养。将菌体悬浮裂解和中和后 ,经澄清和浓缩处理 ,上阴离子交换色谱和体积排阻色谱进行纯化 ,首次提纯出符合药学规格的猪瘟DNA疫苗 ,且整个工艺回收率达 64.53% ,从而表明所建立的工艺为猪瘟DNA疫苗规模化生产奠定了技术基础。
γ-多聚谷氨酸是一种生物可降解的高分子材料 ,可应用于许多领域 ,因此受到普遍的重视。目前γ-PGA液体发酵水平为 5 0～ 60g/ L。报告了用大豆固体发酵生产γ-PGA的方法 ,其中包括 :菌种的筛选 ,发酵和提纯方法 ,高压液相法测定含量和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果 :BacillussubtilisnattoHW_1发酵活性为 1 1 5g/ kg大豆。γ_PGA的纯度为 95 %以上 ,分子质量为31 6kDa。另外可在大豆固体发酵生产纳豆激酶的同时生产回收γ-PGA ,既可以降低产品成本 ,又可以开发应用γ-PGA。
本研究利用农药鱼藤酮作用于神经细胞 ,观察鱼藤酮对神经细胞的损伤作用以及线粒体功能障碍与α- synuclein积聚之间的关系。方法 :本实验选用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y ,实验组为α-synuclein GFP基因转染的细胞 ,鱼藤酮处理的转基因细胞和非转基因细胞 ,对照组为未处理的SH-SY5Y细胞。通过RT-PCR检测α-synuclein基因转染细胞的基因表达情况。荧光显微镜观察细胞内α-synuclein GFP表达产物绿色荧光蛋白。MTT法检测各组细胞活性。DCF检测细胞氧应激。HE染色、免疫组化检测α-synuclein在细胞中的状态。电镜观察细胞超微结构的改变。结果 :RT-PCR显示转基因细胞α-synuclein基因的表达。荧光显微镜观察显示细胞浆内可见绿色荧光蛋白 ,绿色荧光分布不均匀 ,可见蛋白积聚。MTT检测结果显示 ,与对照组相比 ,鱼藤酮处理的细胞增殖速度明显减小 (P <0. 01 )。鱼藤酮的浓度为 75nmol/ L、1 0 0nmol/ L时 ,未转基因与转基因的细胞活性相比较 ,前者的细胞活性低于后者 (P <0 .0 5 )。HE染色 ,鱼藤酮处理的转基因细胞胞浆减少、转基因细胞胞浆内也可见自噬体。胞浆内有嗜酸性包涵体样结构。免疫组化可见鱼藤酮处理高表达α-synuclein细胞明显变成梭形并有很长的突起。电镜显示鱼藤酮处理的细胞线粒体肿胀 ,嵴断裂 ,胞浆内形成自噬体。DCF检测转基因细胞内存在明显的氧化应激 ,并随鱼藤酮处理加重。结论 :农药鱼藤酮对多巴胺能神经细胞有明显的损伤作用 ,转基因细胞显示对较高浓度的鱼藤酮损伤有一定的耐受作用。α-synuclein可引起神经细胞的氧化应激并随鱼藤酮处理加重。提示环境因素可能与α-synuclein表达相互作用使多巴胺能神经元氧化应激进行性加重 ,这可能是引起PD的主要原因。
对一种重组枯草杆菌纤溶酶 (rBSFE)的酶学性质进行了初步研究 ,结果表明 :酶作用最适温度为 35℃ ;最适反应pH为 8.0 ;酶活性能被PMSF抑制 ,是典型的丝氨酸蛋白酶。通过与尿激酶进行比较 ,发现该酶对纤维蛋白有直接降解作用 ,而对于纤维蛋白原的敏感性则低于尿激酶 ,提示该酶具有直接溶栓作用 ,又不致引起出血 ,是一种有潜力的新型溶栓剂。
生物产业是当今具有生机和活力的先导性、战略性产业 ,对经济社会发展具有重要带动作用 ,正在成为继信息产业之后新的经济增长点 ,对新一轮经济增长提供重要支撑。同时 ,生物产业关系人类健康和动植物安全 ,是未来国际竞争的制高点。我国生物产业发展具有良好的人才条件和科研基础 ,产业发展初具规模 ,出现了明显的集聚化趋势。当前 ,我国生物产业发展正处于起步阶段 ,国家应采取有效的政策措施 ,加快生物产业发展步伐 ,培育新的经济增长点。
