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中国生物工程杂志

CHINA BIOTECHNOLOGY
中国生物工程杂志
中国生物工程杂志  2021, Vol. 41 Issue (10): 28-32    DOI: 10.13523/j.cb.2106006
技术与方法     
基于TCID50检测AAV9载体制品感染性滴度的方法
王聪1,2,李秀2,牛苗2,戴阳光2,董哲岳2,董小岩2,余双庆2,*(),杨怡姝1,*()
1 北京工业大学 北京 100124
2 北京五加和基因科技有限公司 北京 102629
Research on AAV9 Infectious Titer Detection Method Based on TCID50
WANG Cong1,2,LI Xiu2,NIU Miao2,DAI Yang-guang2,DONG Zhe-yue2,DONG Xiao-yan2,YU Shuang-qing2,*(),YANG Yi-shu1,*()
1 Beijing University of Technology, Beijing 100124,China
2 Beijing FivePlus Gene Technology Co., Ltd., Beijing 102629, China
 全文: PDF(573 KB)   HTML
摘要：

目的:建立一种基于半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID50)检测9型腺相关病毒(adeno-associated virus type 9,AAV9)载体制品感染性滴度的方法。方法:利用含AAV2 rep和cap基因的1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type1,HSV1)做为辅助病毒与梯度稀释的AAV9载体制品共同感染HEK-293细胞,培养48 h后用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)扩增AAV特异性反向末端重复序列(inverted terminal repeats,ITR),根据阳性及阴性感染孔数,利用Kärber法计算样品的TCID50。结果:采用携带增强绿色荧光蛋白报告基因的AAV9载体制品确定辅助病毒HSV1-rc最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5,AAV9-101的感染性滴度为1.6×109 TCID50/mL。结论:对AAV9载体制品进行感染性滴度检测,且具有可重复性。
关键词： 9型腺相关病毒载体;  感染性滴度;  半数组织培养感染剂量    
Abstract:

Objective: To establish a method for detecting the infectious titers of adeno-associated virus type 9 (AAV9) vector products based on the median tissue culture infective dose (TCID50). Methods: HEK-293 cells were co-infected with HSV1 containing rep and cap genes of AAV2 and gradient diluted AAV9 vector products. After 48 hours of culture, the AAV-specific inverted terminal repeats (ITR) were amplified by quantitative real-time PCR(qPCR), and the infectivity titer of the sample was calculated by the Kärber method based on the number of positive and negative infected wells. Results: The AAV9 vector product carrying the enhanced green fluorescent protein reporter gene was used to determine the optimal multiplicity of infection (MOI) of the helper virus HSV1-rc as 5. The infectious titer of AAV9-101 is 1.6×109 TCID50/mL. Conclusion: This method can detect the infectious titer of AAV9 vector products with repeatability.
Key words: Adeno-associated virus type 9 vector    Infectious titer    Medina tissue culture infective dose
收稿日期: 2021-06-03 出版日期: 2021-11-08
ZTFLH:  Q819  
通讯作者: 余双庆,杨怡姝     E-mail: yushuangqing@five-plus.com.cn;yishu-y@bjut.edu.cn
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王聪
李秀
牛苗
戴阳光
董哲岳
董小岩
余双庆
杨怡姝

引用本文:

王聪,李秀,牛苗,戴阳光,董哲岳,董小岩,余双庆,杨怡姝. 基于TCID50检测AAV9载体制品感染性滴度的方法[J]. 中国生物工程杂志, 2021, 41(10): 28-32.

WANG Cong,LI Xiu,NIU Miao,DAI Yang-guang,DONG Zhe-yue,DONG Xiao-yan,YU Shuang-qing,YANG Yi-shu. Research on AAV9 Infectious Titer Detection Method Based on TCID50. China Biotechnology, 2021, 41(10): 28-32.

链接本文:

https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/10.13523/j.cb.2106006    或    https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2021/V41/I10/28

图1  PCR扩增rep或cap基因
图2  HSV1-rc不同MOI时AAV9-EGFP的表达
稀释倍数 CT值 阳性孔数 阳性孔比
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
106 25.75 23.88 24.29 24.31 23.58 24.00 25.04 24.45 24.58 24.70 10 1
107 27.96 30.70 29.93 30.37 29.09 30.23 28.68 26.34 30.42 30.39 10 1
108 32.85 33.21 33.06 33.11 32.39 31.99 33.06 33.01 32.36 32.54 4 0.4
109 34.18 33.17 34.36 33.57 33.38 33.80 33.36 34.31 33.97 34.33 0 0
1010 33.12 35.01 34.32 32.17 33.66 34.27 33.76 34.11 33.20 33.38 0 0
NC 33.71 33.39 33.83 33.54 34.15 34.07 33.39 34.14 33.47 33.98 0 0
表1  qPCR检测AAV9-101的CT值
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