噬菌体是一种通过感染易感细菌以开启自身复制和生存生命周期的病毒,是地球上数量最多的生物实体,其数量约有10
31个
[1]。噬菌体在肠道中也有广泛的分布,在许多方面都对人体起着至关重要的作用,如改变肠道菌群组成
[2]、加剧或减轻肠炎等疾病
[3]、通过肠脑轴影响大脑功能等
[4]。尽管噬菌体与其宿主之间为“捕食者”与“被捕食者”的关系,但二者之间的相互作用却不能用简单的拮抗模型来解释。例如,删除大肠杆菌BW25113中所有的前噬菌体会增加菌株对外源性应力的敏感性并降低其生长速率,该机制目前尚不清楚
[5]。这一现象说明噬菌体与细菌宿主间的相互作用机制是复杂的,在长期的共同进化过程中,噬菌体与细菌宿主最终形成了各异的相互作用机制。针对细菌基因组的相关研究表明,近一半的测序细菌在其染色体内至少含有一个整合的噬菌体元件,这说明噬菌体-细菌宿主之间的相互作用在自然界中是广泛存在的
[6]。研究表明,群体密度很可能是影响噬菌体-宿主关系的重要因素
[7],能够感知群体密度的群体感应机制也成为噬菌体与宿主间的重要通讯机制。
群体感应(quorum sensing,QS)作为一种微生物间的通讯机制,可以动态调节微生物的各种新陈代谢和生理活动
[8-9]。在过去很长一段时间里,关于QS机制的研究主要着眼于细菌,而近年来随着宏基因组、宏蛋白组等检测技术的不断成熟,对噬菌体中QS机制的挖掘成为可能。Bruce等
[10]通过构建温和噬菌体产生和响应信号多肽的动力学数学模型并辅以实验验证,进一步说明QS信号分子可以对噬菌体溶原裂解的过程进行调控,以帮助其更好地适应外部环境变化。目前,关于细菌-噬菌体中QS模块的研究,多数聚焦于讨论QS系统所调节的生物学功能及蛋白模块的分子机理。在调节生物功能方面,León-Félix等
[11]探讨了各类信号分子的作用以及QS机制对噬菌体生命周期等生物功能的调控能力,其中着重介绍了QS对噬菌体与细菌宿主的动力学影响以及促进水平基因转移等作用。Wang等
[12]描述了细菌在抵御噬菌体侵染过程中QS系统起到的效果以及噬菌体与细菌基于QS机制的交流进程。在总结蛋白模块的分子机理方面,噬菌体内QS模块的分子结构和调控也有报道
[13⇓⇓-16]。然而,现有研究大多关注的是噬菌体内群体交流,从噬菌体到细菌单一方向的表型调控以及噬菌体-细菌的其他相互作用,而对基于QS的噬菌体和细菌的双向相互作用的研究较少
[7]。
本文从噬菌体与细菌宿主基于QS机制进行双向互作的角度总结该领域的相关研究,具体包括:噬菌体侵染时,细菌在生物被膜阻隔、噬菌体吸附位点调控、胞内抵御噬菌体三个阶段中应用QS系统躲避噬菌体侵染的机制;噬菌体利用介入细菌QS及调控自身QS的方式实现决策溶原-裂解生命进程及抑制细菌QS的策略;细菌-噬菌体QS领域在治疗应用以及QS模块挖掘解析的新趋势以及噬菌体-细菌之间的相互作用的新思路。
1 细菌利用QS躲避噬菌体侵染
细菌可利用多种方式对噬菌体的侵染进行抵抗
[17⇓⇓-20],其中QS机制是一种重要的调控手段,QS信号传导更强的菌株可表现出更好的抗噬菌体能力
[21]。细菌宿主利用QS机制对细菌生物被膜、噬菌体吸附位点、CRISPR-Cas系统等方面进行调节,目的是在具有较高感染风险时提升自身的防御能力。
1.1 QS调节细菌生物被膜
生物被膜是一种细菌聚集体,通过细胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)附着于生物或非生物表面,能够抵御干燥、宿主防御系统和抗生素等外部环境压力
[22-23]。生物被膜对噬菌体拥有抵抗能力
[24],在噬菌体侵染细菌的过程中,生物被膜的包裹可以掩蔽噬菌体吸附位点,从而避免细菌被对应噬菌体清除。因此,当噬菌体对宿主细菌开始侵染前,需要首先跨过生物被膜的阻碍
[25]。
QS系统可以协调生物行为以促进生物被膜形成
[26],当群体密度超过临界密度时,将通过级联信号引起基因表达变化,进而改变细菌的行为。在生物被膜形成初期,QS将细菌从浮游状态转变为聚集状态,并使其持续分泌糖类、蛋白质、脂类、细胞外DNA等复杂混合物,从而形成生物被膜
[27⇓-29]。QS系统会介导生物被膜对噬菌体的侵染产生反应
[30]。例如,当低浓度噬菌体对生物被膜内的细菌进行侵染时,细菌宿主中的QS分泌基因(如大肠杆菌中的Lux系统及铜绿假单胞菌中的Las系统)将会上调,相比于未暴露于噬菌体的对照组上调4.1~24.9倍,从而促进生物被膜的产生及成熟,并形成更加致密的结构,抵御噬菌体的侵染;当暴露于高浓度噬菌体时,该类基因又会被少量抑制
[30](
图1)。此外,φH20样噬菌体也对其宿主鳗弧菌90-11-287有着类似的影响。Tan等
[31]构建了
ΔvanO以及
ΔvanT两个QS基因突变体,前者会表达高水平的QS转录因子VanT,使得细菌被锁定在高细胞密度的QS模式中,后者则不表达VanT,无法激活QS,细菌被锁定在低细胞密度的QS模式中。实验表明,当细菌处于低细胞密度状态时,φH20样噬菌体会促进细菌生物被膜的产生;当细菌处于高细胞密度状态时,QS会抑制前噬菌体的诱导,从而保护细菌宿主。综上可知,QS可通过调控生物被膜对噬菌体产生抵抗作用,这是细菌宿主躲避噬菌体的方式之一。
Fig.1 Regulation of biofilm formation by bacteria via quorum sensing system[37]图1 细菌利用群体感应系统调控生物被膜形成[37] |
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1.2 QS调控噬菌体吸附过程
吸附是噬菌体开始侵染细菌宿主的第一阶段。在该阶段中,噬菌体利用黏附蛋白或受体结合蛋白(receptor binding proteins,RBPs)作为吸附装置,辅以其他接受RBP结合信号的病毒粒子成分,附着于细菌宿主受体之上,进而完成吸附过程
[32]。QS可通过调节细菌表面受体对吸附过程进行调控。Ding等
[33]在研究AI-2介导的QS在抵抗T4噬菌体感染中的作用以及对大肠杆菌代谢的调控机制时发现,当AI-2 QS信号分子存在时,T4噬菌体吸附受体基因
ompC、
waaA和
waaQ表达量分别降低了60%、65%和85%,噬菌斑数量减少了约26%。这说明信号分子AI-2的加入减少了噬菌体的吸附,从而增加了宿主对T4噬菌体的抗性。Høyland-Kroghsbo等
[34]在大肠杆菌K-12中发现,细菌可响应N-酰基-l-高丝氨酸内酯(
N-acyl homoserine lac-tone,AHLs)QS信号,通过SdiA受体转导使细胞表面LamB蛋白水平降低40%,最终导致噬菌体吸附率降低约二分之一。此外,有研究发现在铜绿假单胞菌中,IV型菌毛T4P可作为铜绿假单胞菌噬菌体vB_Pae_S1和vB_Pae_TR的重要受体,而吲哚可以通过下调基因
pilA、
pilB和
pilQ的表达,进而减少T4P介导的噬菌体吸附来保护铜绿假单胞菌免受噬菌体感染
[35]。尽管该进程并未与AHL介导的QS进行直接的相互作用,但吲哚作为一种细胞间信号分子
[36]或许拥有成为特定QS信号分子的潜力。
一些研究也表明QS会对噬菌体的吸附产生正面效应。Xuan等
[38]在研究
las和
rhl QS对噬菌体侵染铜绿假单胞菌(
Pseudomnas aeruginose)PAO1过程中所起的作用时发现,
las QS的存在有助于噬菌体的侵染。进一步研究发现,
las QS上调了脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)合成的关键基因
galU的表达,而LPS作为噬菌体的吸附位点,其含量增多导致了噬菌体吸附率增加,从而增加了噬菌体的感染。有关QS正向调控噬菌体吸附过程的案例相对较少,但该现象表明QS对噬菌体吸附过程的调控作用是复杂的(
图2),对该领域的研究有望促进利用QS提高噬菌体治疗中的噬菌体侵染效果
[39-40]。
Fig.2 Regulation of bacterial phage receptor sites via quorum sensing system图2 细菌利用群体感应系统调控噬菌体吸附位点 |
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1.3 QS调控CRISPR-Cas系统
CRISPR-Cas [clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated systems (Cas) ]系统最早于1987年在大肠杆菌中被发现
[41],是一种由细菌进化来的避免噬菌体侵染的免疫机制。CRISPR-Cas系统由Cas蛋白和CRISPR阵列组成,Cas蛋白包含核酸酶以及解旋酶等功能蛋白结构域,CRISPR阵列则包含由外源DNA构成的间隔区及多个重复序列
[42]。
CRISPR-Cas系统发挥作用需要经过适应、加工以及干扰三个阶段。当噬菌体开始侵染后,CRISPR-Cas系统进入适应阶段,此阶段中Cas蛋白与噬菌体DNA进行结合并获得噬菌体中的片段,进而将其插入CRISPR阵列中的两个重复序列之间
[43],使细菌获得对该种噬菌体的适应性免疫能力。在加工阶段,CRISPR阵列将会被转录成一个单独的长转录本(pre-crRNA),通过Cas蛋白等的进一步加工产生成熟的crRNA,并进入最终的干扰阶段。crRNA会与Cas蛋白共同发挥作用剪切外源DNA,防止外源DNA的侵入
[44]。QS系统对CRISPR-Cas系统有着重要的调控作用,该作用可使细菌宿主根据环境条件情况调控生理反应,从而降低适应成本
[45-46]。Patterson等
[47]发现QS系统对沙雷菌中所有CRISPR-Cas系统都具有调节能力,AHLs QS信号分子可以与SmaR转录调节因子相结合,阻止SmaR对CRISPR和
cas基因的表达抑制
[48]。这一现象说明,在高细胞浓度情况下,CRISPR-Cas系统发挥作用会被QS系统增强,起到更强地抵御噬菌体的效果。在适应阶段,环境中的AHLs QS信号分子能够增强CRISPR-Cas系统对新的间隔区的获取,从而增强细菌的适应性免疫记忆。Høyland-Kroghsbo等
[49]对铜绿假单胞菌中CRISPR-Cas系统的研究发现,CRISPR-Cas系统的强度随细胞密度的变化而变化。在高细胞密度下,QS信号分子将会诱导
cas基因的表达,从而在感染风险相对较高的状态下激活CRISPR-Cas系统;而在低细胞密度下,感染风险相对较低,此时减少CRISPR-Cas系统的启动可以降低免疫成本。Lin等
[50]在铜绿假单胞菌PA14中发现QS调节因子CdpR可以通过QS机制抑制CRISPR-Cas的表达以及间隔序列的获取,是CRISPR-Cas系统的第一个内源性负调控因子。此外,有研究利用QS机制主动干预CRISPR-Cas系统,如使用QS干扰酶调节铜绿假单胞菌CRISPR-Cas系统,使CRISPR-Cas系统相关基因的表达减少
[51],这使得利用QS机制操控噬菌体与宿主关系成为可能。
当前多数的研究支持QS机制可以在高密度情况下促进CRISPR-Cas系统,这可以从较高细胞密度感染风险也较高的角度进行解释。然而,也有研究表明QS对CRISPR-Cas系统有抑制作用。例如,在金黄色葡萄球菌中,
agr QS系统通过抑制SarA和ArcR两种正调控因子,进而抑制CRISPR-Cas系统的功能
[52](
图3)。
Fig.3 Regulation of CRISPR-Cas system by bacterial quorum sensing图3 细菌利用群体感应系统调控CRISPR-Cas系统 |
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QS机制对CRISPR-Cas系统的调控在不同菌种中不尽相同。CRISPR-Cas系统一方面会增加细菌宿主对噬菌体的免疫力,但同时也会增加适应性成本
[53],平衡这一关系对于未来QS-噬菌体联合治疗有着重要的现实意义。
1.4 细菌QS调控的其他抗噬菌体机制
QS系统可以介导基于环寡核苷酸的抗噬菌体信号系统(cyclic oligonucleotide-based anti-phage signaling system,CBASS)调控噬菌体-细菌宿主相互作用。CBASS系统是一种细菌的抗噬菌体防御方式,包含cGAS/dncv样核苷酸基转移酶(cGAS/DNCV-like nucleotide transferase,CDNTase)和CD-NTase相关蛋白(CD-NTase-associated protein,Cap)效应子。当CBASS系统感知到噬菌体复制时将会催化核苷酸第二信使信号的合成以启动抗病毒防御,通过诱导细胞死亡的方式抗击噬菌体侵染
[54]。Severin等
[55]研究发现在高细胞密度下,霍乱弧菌QS系统将诱导寡核苷酸环化酶(dncv)和CBASS磷脂酶效应物(capV)的转录增强,进而提高对噬菌体的抵抗能力。此外,霍乱弧菌在高细胞密度状态下可上调
ddmABC操纵子的活性进而提高对噬菌体的抵抗能力
[56]。Qin等
[57]发现QS系统可能通过影响活细胞比例和活细胞状态参与噬菌体感染的调控。
大量细菌QS抵抗噬菌体新机制的发现表明,细菌QS模块的深挖及其调控的生理反应仍有巨大的研究潜力。
2 噬菌体利用QS机制调控细菌生长
QS作为一种密度依赖型的通讯机制,可以协助噬菌体感知外界宿主密度及噬菌体密度,帮助其进行生存策略选择。噬菌体可通过利用QS调节溶原-裂解进程
[58]以及直接抑制细菌宿主QS的方式介入到细菌宿主及自身生命进程的调控过程中。
2.1 调节溶原-裂解生命进程
通常而言,噬菌体可按其生命进程的不同分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体
[59-60]。裂解性噬菌体在侵入细菌后会不断复制自身遗传物质及蛋白质外壳并在宿主体内进行组装,当子代噬菌体组装完成后会将宿主细菌裂解并将子代噬菌体释放到环境中进行后续侵染。溶原性噬菌体则在侵染宿主后将自身的遗传物质嵌入宿主细胞的染色质当中,实现自我复制
[61]。噬菌体可利用细菌宿主或自身的QS系统调节自身的溶原-裂解状态,使其更加适应环境变化
[62-63](
图4)。
Fig.4 Quorum sensing-mediated regulation of bacteriophage lysis-lysogeny switch图4 噬菌体通过群体感应调控自身溶原-裂解过程 |
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2.1.1 噬菌体应用细菌群体感应机制
多项研究证明,噬菌体可以依靠宿主的QS系统对自身的生命周期进行调控
[64-65],其中较有代表性的为Silpe等
[66]在霍乱弧菌及其噬菌体VP882中发现的VqmA QS系统。在霍乱弧菌中存在一套由自诱导物3, 5-二甲基吡嗪醇(dimethylpyrazinol,DPO)和受体VqmA共同组成的QS系统,其作用是抑制毒性和生物被膜形成的基因。霍乱弧菌的噬菌体VP882能够编码蛋白Gp56(VqmA
Phage),这是一种可以结合DPO的受体蛋白,与弧菌QS受体VqmA同源。当霍乱弧菌培养物达到高细胞密度时,环境中的DPO浓度增高,VqmA
Phage可通过结合DPO被激活,导致噬菌体抗抑制蛋白Qtip(quorum-triggered inactivator of cI protein)表达上调
[66],并隔离噬菌体cI阻遏物,最终导致噬菌体进入裂解周期。值得注意的是,VqmA
Phage可以结合自身的启动子,同时也可以结合宿主的启动子,但宿主所产生的VqmA蛋白不能与噬菌体的启动子相结合。这一机制是为了确保噬菌体不仅可以对宿主的QS系统进行监听和产生反应,同时也能够保护噬菌体不受宿主蛋白的干扰,自行决定自身的溶原裂解过程
[67]。在气单胞菌
ARM81中同样也发现了噬菌体φARM81ld,其名为
p37的基因编码一种假定的
luxR型转录因子(LuxR
ARM81ld)。LuxR
ARM81ld能够与宿主气单胞菌属成员产生的C4-HSL(
N-butanoyl-DL-homoserine lactone)QS信号分子相结合。此外,
Aeromonas popoffii中的噬菌体同样包含
luxR型受体,但并不与噬菌体的溶原裂解机制直接相关,其可能调控细菌的其他生物功能,如重复感染排除等
[68]。大肠杆菌ATCC 14155携带与肠杆菌噬菌体T1具有99.86%同源性的前噬菌体,与裂解性T1噬菌体不同,该前噬菌体可采用溶原形式宿于宿主体内。Laganenka等
[69]研究发现将ATCC 14155与包含
luxS基因的W3110共培养时,
luxS所编码的AI-2 QS信号分子将会诱导前噬菌体发生裂解。进一步研究发现,噬菌体编码的转录调控因子Pir会因AI-2的存在而上调,其具体机制目前尚不清晰,但足可证明AI-2信号分子可调控溶原性噬菌体的裂解开启。噬菌体对细菌宿主的QS机制的监测和利用反映了外部环境因素对噬菌体溶原-裂解生命进程的调控作用,同时也体现了噬菌体与细菌宿主之间的信息交流。目前,通过同源预测
[70]等方式已在更多的噬菌体中发现了包含宿主QS模块的片段,而在多种菌属中均发现噬菌体受到宿主QS机制影响,这代表该现象可能广泛存在于噬菌体中。在自然界中,大多数潜在溶原-裂解决策调控机制尚未被发现,目前研究的重点在于发掘新的噬菌体QS模块,在未来的研究中,QS在噬菌体中的作用以及机制解析具有较大的研究潜力。
2.1.2 噬菌体自身群体感应机制调控溶原裂解
Erez等
[71]研究发现,phi3T噬菌体中存在一种名为“仲裁肽”的QS系统,由AimX、AimR和AimP三部分组成。AimX是一种非编码RNA,用于沉默
cI抑制因子,促进噬菌体的裂解过程。AimR编码一种转录因子,可激活AimX并与AimP结合。AimP编码一种短蛋白,在被细胞外蛋白酶进一步加工后,能够产生6个氨基酸的仲裁肽信号分子,这些信号分子通过细菌的寡肽渗透酶(oligopeptidase,OPP)通道从外部环境进入细胞内。当环境中噬菌体的浓度较低时,细胞内仲裁肽信号的浓度较低,AimR便会与AimX启动子结合并促进噬菌体的裂解。相反,当环境中噬菌体浓度较高时,细胞内仲裁肽信号的浓度便会升高,AimP信号分子会与AimR转录因子结合,从而促进噬菌体的溶原过程。
“仲裁肽”系统的存在揭示了噬菌体内部基于群体密度的互动机制,后续研究发现“仲裁肽”系统在自然界中广泛存在。Stokar-Avihail等
[72]利用PSI-BLAST方法在一个包含6万余种细菌、古细菌和病毒基因组的数据库中进行同源性搜索,检索到1 180个AimR同源体,其中96%位于
aimp样基因的直接上游,说明噬菌体通过信号分子进行交流是一个普遍现象。Bernard等
[73]在芽孢杆菌噬菌体phi3T的基因组中鉴定出了一种与宿主QS系统同源的Rapφ-PhrφQS系统,推测该系统可在噬菌体感染期间下调宿主的防御机制,其中Rapφ蛋白可以延迟其新溶原的细菌宿主中公共产物的生产,使得噬菌体更好地进行溶原过程。
目前对于噬菌体内QS机制的研究尚有不足,尤其是新的QS模块的发掘工作。未来随着新的基因检测技术及生物信息分析技术不断涌现和发展,该领域或将有更多的进展和发现。
2.2 抑制细菌群体感应系统
细菌宿主广泛运用QS系统调控自身状态以避免被噬菌体侵染,在长期的共同进化中,噬菌体也进化出了抑制细菌宿主QS的机制。噬菌体侵染会改变细菌内部和细菌间QS相互作用相关的基因表达,进而影响复杂的微生物行为
[74](
图5)。Rutbeek等
[75]在化脓性链球菌(
Streptococcus pyogenes)中发现了一个噬菌体通过编码蛋白抑制细菌宿主QS机制的案例。化脓性链球菌中包含一套名为COMRS的QS系统,其中ComR是一种QS受体和转录因子,属于Rnpp蛋白家族的Rgg亚群,与其结合的是一种名为XIP的短肽。ComS编码XIP,被加工后形成由7~8个氨基酸构成的小信息素分子,XIP与ComR结合能够调控形成正反馈QS回路。而化脓性链球菌中的前噬菌体会编码一种名为Prx的蛋白,能够在体外和体内抑制该信号回路。针对其分子机理的进一步研究表明,Prx蛋白可以诱导apo-ComR发生构象变化,并进入其DNA结合域,从而阻碍ComR与ComS和
sigX的目标启动子区域的关联
[75-76]。
Fig.5 Bacteriophage-mediated inhibition of bacterial quorum sensing system图5 噬菌体抑制细菌群体感应系统 |
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噬菌体可以通过此种形式阻碍宿主的信号交流并调控其自然转化的功能。例如,Chatterjee等
[77]在鉴定噬菌体VPE25感染粪肠球菌所必需的细菌基因时发现,噬菌体侵染的过程会导致一种名为
fsr的QS基因表达量显著降低。
fsr系统由
fsrA、
fsrBD和
fsrC三部分组成,被认为与细菌生物被膜的形成密切相关。当VPE25进行侵染时,
fsrBD和
fsrC的表达受到抑制,并且抑制程度随时间而增强。该现象暗示噬菌体侵染可能通过干扰QS机制减弱生物被膜的形成,进而有利于自身的侵染过程。另有研究发现噬菌体NPV-1也拥有对粪肠球菌
fsrB基因的抑制作用,当NPV-1进行侵染时,
fsrB的mRNA水平下降
[77]。此外,噬菌体也可以编码QS抗激活蛋白Aqs1,它能够抑制QS的主要调节因子LasR的活性,并与IV型菌毛组装ATP酶蛋白PilB结合,使得表达Aqs1的噬菌体阻止宿主抗噬菌体防御能力的上调,并保护受感染的细胞免受其他噬菌体的攻击
[78]。
3 总结与展望
随着抗生素的广泛使用,细菌的耐药性问题逐渐严峻,噬菌体疗法作为能够有效解决抗生素耐药问题的解决方案重新得到了关注
[39]。研究表明,噬菌体不仅可直接杀灭病原体,还能通过增加选择性压力的方式来影响细菌群落稳态
[79]。此外,噬菌体在消除生物被膜
[80]以及癌症治疗领域
[81]也有着巨大的潜力。对噬菌体与细菌宿主之间的相互作用机制进行解析可为噬菌体治疗打下良好的基础,而破解二者通过QS的双向互作交流机制也为发展噬菌体应用于微生物群落控制等方面提供了潜在的工具。针对QS介导的微生物间通讯网络(QS communication network,QSCN)的研究
[82-83]不仅可以助力合成微生物群的稳定性构建以促进肠道疾病的潜在治疗
[84]和代谢生产的效率提升
[85-86],更是噬菌体QS相关研究的基础和重要方向。
目前,受限于大部分噬菌体仍处于未培养状态,对噬菌体及细菌间的QS系统的研究主要着眼于对可培养噬菌体内QS系统的发掘及表征,对其内部所代表的生物学意义则研究较少,同时对于未培养的噬菌体中的QS模块关注度不足。噬菌体中QS模块的发掘工作尚有巨大的研究空间
[72],尤其是对现有QS模块序列特征和结构特征的学习等方面。未来值得关注的研究方向包括:(1)基于不断扩大的噬菌体基因数据库,利用机器学习等工具继续挖掘未培养噬菌体中的QS机制;(2)可利用多组学技术对噬菌体中的QS模块具体调控何种生理活动以及其具体调控机制进行深度研究。
总之,QS机制在细菌和噬菌体之间的双向相互作用中发挥着至关重要的作用。未来将通过更多的研究来深入理解这种相互作用的生物学机制,从而为医疗、控制细菌感染等提供更有效的策略。
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Fig.1 Regulation of biofilm formation by bacteria via quorum sensing system[37]
