氧化还原酶广泛应用于手性化合物的制备
[1],其催化反应过程需要NADH或NADPH作为辅酶。近些年在针对非天然产品的制备研究中,发现大多数具有高立体选择性和高催化活力的氧化还原酶都是NADPH依赖型
[2]。由于NADPH自身不稳定、价格昂贵且需要等当量消耗
[3],需要通过辅酶再生酶的催化进行原位再生体。目前的研究中,主要使用葡萄糖脱氢酶进行NADPH的再生
[4,5],但由于副产物葡萄糖酸的产生,导致过程原子经济性差、产品精制成本高、环保压力大,已不满足现今的工业要求。而醇脱氢酶以异丙醇作为原料再生NADPH,具有原子经济性高、副产物丙酮易于分离等优势,具有极高工业应用潜力。文献报道的醇脱氢酶多数是NADH依赖型,可用于原位再生NADPH的醇脱氢酶种类较少。催化NADPH再生的比活力较高的醇脱氢酶有来源于
Thermococcus guaymasensis strain DSM 11 113的TgADH
[6]以及来源于
Methanogenium thermophilum的MtADH
[7],催化异丙醇再生NADPH的比酶活分别为245 U/mg蛋白(35℃)和176 U/mg蛋白(40℃);但这两种酶蛋白稳定性差,室温条件下在空气中易失活,不利于工业化应用。此外,热稳定性较好的NADPH依赖型醇脱氢酶有来源于
Thermoanaerobium brockii的TbADH
[8]以及来源于
Entamoeba histoytica的EhADH
[9],这两种酶的
(保温60min后酶活损失一半的温度)温度分别为93.8℃、77.5℃,但二者的比酶活分别只有59U/mg蛋白(40℃)和29U/mg蛋白(25℃);此外,来源于嗜热菌株
Thermoanaerobacter ethanolicus的醇脱氢酶TeADH也具备高热稳定性,但其比活仅有60U/mg 蛋白(60℃)
[10];而来源于
Clostridium beijerinckii的CbADH在25℃下比酶活达到了140 U/mg蛋白
[11],且其
(保温60min后酶活损失一半的温度)也有64.5℃,CbADH兼具高比活和高稳定性,是目前最为合适的可用于辅酶NADPH再生的醇脱氢酶。
关于CbADH的研究主要集中在对其晶体结构解析
[12]与热稳定性改造
[13]。如,Bogin等
[14]通过构建CbADH与TbADH的嵌合体,探索影响醇脱氢酶的热稳定性的结构因素;Goihberg等
[15]用定点突变技术将CbADH的100位点的谷氨酰胺替换为脯氨酸,使其
提高了8℃。然而,对于CbADH异源表达的研究则较少,Peretz等
[11]和Ismaiel等
[16]将CbADH克隆、测序并构建到pUC18质粒上,转化进入
E.coli DH5α菌株中进行异源表达,CbADH的发酵液酶活仅为1.73 U/ml。由于缺乏针对CbADH的高效、简便的异源表达策略,限制了CbADH的工业应用。为使CbADH高水平表达,本研究首先构建pET-28a(+)/CbADH质粒,并在大肠杆菌表达宿主
E.coli BL21(DE3)上重组表达CbADH。其次,为了解决CbADH高表达可能产生的可溶性差的问题,引入分子伴侣与目标酶共表达,并优化共表达策略,以获得CbADH的高产菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 E.coli BL21(DE3)感受态细胞由本实验室保藏;pCas,pTargetF质粒以及5种表达分子伴侣蛋白的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-tf2、pTf16)购自宝生物工程有限公司(大连);载有CbADH基因(NCBI登录号WP_077844196.1)的pET-28a(+)质粒、引物合成与测序均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
1.1.2 主要试剂 DNA marker、DNA Polymerase、Protein SDS PAGE Loading Buffer等购自宝生物工程有限公司(大连);卡那霉素(Kan)、壮观霉素(Spe)、氯霉素(Cm)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、四环素等试剂购自北京鼎国生物技术有限公司;质粒DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自杭州Axygen公司;Protein Ladder购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司;辅酶NADP+购自邦泰生物工程(深圳)有限公司;其他常用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 主要仪器 TU-1810PC型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;Thermomixer型恒温金属浴,德国Eppendorf公司;JY92-II型超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技有限公司;GL-2050M型高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机有限公司;A200型PCR仪,杭州朗基科学仪器有限公司;PowerPac Basic型电泳仪,BIO-RAD (美国)公司。
1.2 方法
1.2.1 CbADH表达菌株构建 CbADH全基因合成序列和pET-28a(+)/CbADH质粒载体构建由北京擎科新业生物技术有限公司完成。将pET-28a(+)/CbADH质粒载体转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,得到E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)/CbADH重组菌株。
1.2.2 分子伴侣与CbADH共表达菌株的构建与培养 把
E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)/CbADH重组菌株制备成感受态细胞,分别将5种分子伴侣质粒(
表1)转化进入其中,将这些菌株依次命名为A,B,C,D,E。在双抗LB固体培养基(含50μg /ml Kan和20μg /ml Cm)上挑取单克隆菌落进行PCR鉴定,并转移到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Kan和20μg/ml Cm)中,在摇床中37℃、200r/min扩大培养12h,保存菌种。
Table 1 Information of molecular chaperone plasmid表1 分子伴侣质粒信息 |
分子伴侣质粒 | 伴侣蛋白 | 启动子 | 诱导剂 | 抗性 |
pG-KJE8 | DnaK-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL | araB Pzt-1 | 0.5g/ml L-Arabinose+5ng/ml Tetracyclin | Cm |
pGro7 | GroES-GroEL | araB | 0.5g/ml L-Arabinose | Cm |
pKJE7 | DnaK-DnaJ-GrpE | araB | 0.5g/ml L-Arabinose | Cm |
pG-Tf2 | GroES-GroEL-Tf | Pzt-1 | 5ng/ml Tetracyclin | Cm |
pTf16 | Tf | araB | 0.5g/ml L-Arabinose | Cm |
1.2.3 pET单质粒共表达菌株的构建 基于pET-28a(+)质粒骨架,通过SD序列的引入,在一个T7启动子下实现两个蛋白的共表达,构建了F和G两个共表达质粒,如
图1所示,质粒F与质粒G之间主要区别是CbADH与GroES-GroEL的构建位置相反。此外,在质粒F与G的基础上用全质粒PCR扩增引入第二个T7启动子,构建了H和I两个共表达载体,如
图1所示。具体步骤参照《分子克隆手册》进行。将质粒F,G,H,I分别转化
E.coli BL21(DE3)感受态细胞,即得到单质粒共表达分子伴侣与CbADH的4种菌株F,G,H,I。
Fig.1 Expression region structure of the co-expression plasmids图1 共表达质粒的表达区域结构示意图 |
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1.2.4 基因组强化表达GroES-GroEL菌株的构建 用CRISPR基因组编辑技术
[17]将GroES-GroEL表达基因groESL前的σ32启动子替换为强度更高的三种组成型启动子:J23119、J23100、J23114(
表2),以实现基因组强化表达GroES-GroEL,基因操作示意图见
图2。获得基因组编辑后的菌株并将它们分别制备为感受态细胞,将pET-28a(+)/CbADH质粒转化进入其中,分别得到基因组强化表达GroES-GroEL的菌株J、K、L。
Table 2 Information of constituent promoters表2 组成型启动子信息①(① 组成型启动子具体信息来源于http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Anderson) |
启动子名称 | 序列 | 相对强度 |
J23119 | ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc | n/a |
J23100 | ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc | 1 |
J23102 | ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc | 0.86 |
J23104 | ttgacagctagctcagtcctaggtattgtgctagc | 0.72 |
J23108 | ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc | 0.51 |
J23110 | tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc | 0.33 |
J23114 | tttatggctagctcagtcctaggtacaatgctagc | 0.10 |
Fig.2 Schematic diagram of CRISPR genome editing modified promoter图2 CRISPR基因组编辑示意图 |
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1.2.5 组成型pGro7和pET双质粒共表达菌株的构建 以pGro7质粒为模板,分别以23119-1/2、23100-1/2、23102-1/2、23104-1/2、23108-1/2、23110-1/2、23114-1/2为引物,以全质粒PCR扩增、将araB
o|p启动子替换为组成型启动子(组成型启动子信息见
表2),转化到
E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)/CbADH菌株感受态细胞中,即完成启动子替换的双质粒菌株的构建,将这些菌株分别命名为M,N,O,P,Q,R,S。
1.2.6 摇瓶发酵产酶 将单克隆菌落挑取至20 ml LB液体培养基中,在摇床中37℃、200r/min培养12h后转入230ml LB培养基中,在摇床中37℃、200r/min培养3h,加入250μl 0.5mol/L IPTG诱导剂,降温到25℃继续培养16h。其中1.2.2中的共表达菌株需进行分子伴侣与CbADH的分级诱导,转接时需在培养基中按
表1加入相应分子伴侣诱导物。
1.2.7 菌体浓度测定 从发酵液中取100μl,用去离子水稀释10倍,用分光光度计在600nm处测定吸光值,菌体浓度(OD600)=10×600nm处吸光值。
1.2.8 细胞干重测定 将发酵液置于100ml 离心管中,4℃、12 000r/min离心5min,倒去上清液,用0.1mol/L pH 7.5的PBS缓冲液在4℃、12 000r/min下离心清洗沉淀3次,获得湿菌体,置于-80℃冰箱中冷冻保存。取一部分冷冻后的菌体,称重后转移到75℃烘箱中烘干。烘干至恒重后即为细胞干重。
1.2.9 醇脱氢酶酶活测定 称取一部分湿菌体,置于100ml离心管中,按1 g/100ml的比例加入0.1 mol/L pH 7.5的PBS缓冲液,重悬细胞,在冰水浴中超声破碎(功率400 W,超声次数100次,每次超声3 s,间隔7s),获得粗酶液。取100 μl粗酶液迅速加入900μl反应液(800μl 62.5mmol/L的异丙醇溶液(pH 7.5),100μl 10mmol/L NADP+溶液,混合后在35℃金属浴中预热10min)中,将总计1ml的反应体系在340nm波长下光度扫描60s,以时间为横坐标、吸光值为纵坐标线性拟合,得到斜率值,再结合NADPH的摩尔消光系数(6220L/mol/cm)计算酶活。酶活定义为:在所述条件下,每分钟生成1μmol NADPH所需的酶量。在本研究中,酶活单位为U/mg干细胞重(DCW)。
1.2.10 SDS-PAGE蛋白电泳 取1.2.9节获得的粗酶液中50μl作为全细胞样品;另取同样的粗酶液1ml,12 000r/min离心10min后,取50μl作为上清样品(可溶蛋白样品);除上清后的沉淀,加入1ml去离子水重悬,取50μl作为沉淀样品。在以上样品中分别加入10μl 4×Protein SDS PAGE Loading Buffer,混匀后于99℃变形10 min,上样进行SDS-PAGE电泳。
1.2.11 蛋白质灰度分析 使用ImageJ软件对蛋白电泳结果进行灰度分析,以确认各个蛋白大致的表达量。将蛋白电泳结果图导入到ImageJ软件中,进行参数设置:将Type调整为8-bit;在substract background中选择light background选项,将rolling ball radius调整为50.0 pixels;在set scale中将unit of length设置为pixels。使用invert功能,将图片转化为黑底。使用freehand selections将要进行灰度分析的区域精准选定,点击Measure进行测量。其中integrated density即为该区域的灰度值。由于选定区域时存在一定的误差,因此选定5次取平均值用于后续工作。
2 结果与分析
2.1 CbADH在E.coli BL21(DE3)中的重组表达
本实验首先构建了pET-28a(+)/CbADH质粒,导入大肠杆菌表达宿主
E.coli BL21(DE3),得到重组表达CbADH的菌株CbADH-WT。SDS-PAGE电泳结果(
图3)显示CbADH在常规诱导表达条件下出现了严重的包涵体,仅获得少量的可溶性蛋白;酶活测定结果(
表3)为2.31 U/mg DCW(约为2.91 U/ml),这与CbADH在
E.coli DH5α菌株中的酶活(1.73U/ml)相近,表明CbADH的异源可溶性表达存在一定困难。
Fig.3 SDS-PAGE analysis of molecular chaperones co-expression strainsLane M:molecular weight marker;Lane W:whole cell protein; Lane S:supernatant;Lane P:precipitation 图3 分子伴侣共表达菌株的SDS-PAGE分析 |
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Table 3 CbADH activity of different strategies表3 不同策略的CbADH发酵液酶活测定结果 |
采用策略 | 菌株名称 | OD600 | 酶活(U/mg DCW) |
出发菌株 | CbADH-WT | 5.91±0.34 | 2.31±0.3 |
分子伴侣共表达 | A | 6.24±0.38 | 11.18±0.96 |
| B | 5.27±0.2 | 3.61±0.21 |
| C | 5.17±0.31 | 3.98±0.14 |
| D | 7.19±0.24 | 4.17±0.35 |
| E | 5.97±0.23 | 2.88±0.09 |
单质粒共表达 | F | 5.4±0.24 | 10±0.35 |
| G | 5.23±0.32 | 7.89±0.46 |
| H | 4.88±0.28 | 8.02±0.43 |
| I | 5.09±0.19 | 12.99±0.89 |
基因组强化表达 | J | 5.23±0.35 | 9.13±0.31 |
| K | 5.31±0.37 | 7.26±0.18 |
| L | 5.28±0.25 | 2.3±0.24 |
组成型双质粒共表达 | M | 5.08±0.41 | 21.79±1.1 |
| N | 5.44±0.24 | 17.74±0.92 |
| O | 5.43±0.32 | 16.8±0.42 |
| P | 5.56±0.21 | 15.57±0.52 |
| Q | 5.79±0.13 | 15.08±0.46 |
| R | 5.55±0.32 | 14.82±0.32 |
| S | 5.32±0.26 | 12.35±0.67 |
2.2 不同的分子伴侣蛋白对CbADH可溶性表达的影响
本实验首先通过简单的商业化质粒、引入不同伴侣蛋白与CbADH共表达,考察分子伴侣蛋白过表达能否提高CbADH的可溶性表达水平。所选分子伴侣表达体系为:Strain A-pGro7/GroES-GroEL、Strain B-pKJE7/DnaK-DnaJ-GrpE、Strain C-pG-KJE8/DnaK-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL、Strain D-pG-Tf2/GroES-GroEL-Tf、Strain E-pTf16/Tf(菌株-质粒/分子伴侣)。各个菌株酶活测定与蛋白电泳结果分别如
表3和
图3所示。
结果显示表达分子伴侣蛋白GroES-GroEL的菌株A的酶活最高,为11.18 U/mg DCW,是出发菌株的4.83倍,其CbADH的可溶性部分明显高于出发菌株。该结果表明分子伴侣蛋白GroES-GroEL可以显著提高CbADH的可溶性表达,而其他分子伴侣蛋白对CbADH的可溶性表达影响不明显。根据分子伴侣蛋白的作用机制,分子伴侣蛋白Tf与DnaK-DnaJ-GrpE作用于蛋白折叠初始阶段、通过保护初生多肽链免于错误聚集
[18,19],而GroES-GroEL主要协助部分折叠态的蛋白克服动力学障碍、正确折叠为其天然状态
[20,21,22]。由此推断CbADH蛋白折叠问题不在于早期的错误聚集,而在于其部分折叠态跨越动力学障碍存在困难。
2.3 pET单质粒共表达策略提高CbADH的可溶性表达
鉴于菌株A表达CbADH仍存在明显的包涵体,为获得更高的CbADH酶活,需要进一步提高GroES-GroEL的表达量。因此,构建了两类pET单质粒共表达策略,其中一类为两种蛋白均在同一T7启动子下表达,另一类为两种蛋白前各有一个T7启动子;分别调换两种蛋白的基因顺序得到4种不同单质粒共表达策略,以获得GroES-GroEL与CbADH不同的表达量和比例。酶活测定与蛋白电泳结果分别如
表3和
图4所示。
Fig.4 SDS-PAGE analysis of pET single plasmid co-expression strainsLane M: molecular weight marker;Lane W:whole cell protein; Lane S: supernatant;LaneP:precipitation 图4 pET单质粒共表达菌株的SDS-PAGE分析 |
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结果显示,单质粒共表达策略实现了GroES-GroEL的增量表达,且CbADH的可溶性表达随着GroES-GroEL的表达量提高而提高。但GroES-GroEL的增量表达导致了CbADH总表达量相比出发菌株和菌株A明显降低,使CbADH的酶活提升不大。此外,菌株H与I同为双启动子共表达,差别在于两个基因的顺序不同。菌株H的GroES-GroEL的表达量较高、CbADH的表达量较低;而菌株I则相反,这是由于第二个T7启动子之后的基因有可能会被转录两次。
2.4 基因组强化表达GroES-GroEL策略提高CbADH的可溶性表达
单质粒共表达策略使分子伴侣蛋白表达量过高,导致目标酶CbADH的蛋白表达量下降。因此尝试了下调GroES-GroEL的表达量的策略以获得更高的CbADH酶活。通过CRISPR基因组编辑技术,将
E.coli BL21(DE3)基因组上的GroES-GroEL表达基因
groESL前的启动子替换为强度更高的三种启动子:J23119、J23100、J23114,分别得到菌株J、K、L,以期实现基因组强化表达GroES-GroEL。酶活测定与蛋白电泳结果分别如
表3和
图5所示。结果显示菌株J,K实现了基因组强化表达GroES-GroEL。虽然其伴侣蛋白表达量和CbADH酶活显著高于出发菌株,但低于菌株A,表明该策略的伴侣蛋白表达量过低,未能有效解决CbADH可溶性表达的问题。
Fig.5 SDS-PAGE analysis of GroES-GroEL genomic over-expression strainsLane M: molecular weight marker; Lane W: whole cell protein; Lane S: supernatant; Lane P: precipitation 图5 基因组强化表达GroES-GroEL的SDS-PAGE分析 |
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2.5 组成型pGro7和pET双质粒共表达策略提高CbADH的可溶性表达
由于GroES-GroEL蛋白表达在单质粒共表达策略中过量,而在基因组强化表达策略中过低。为获得GroES-GroEL表达量适中,CbADH酶活最高的菌株,选用了7种强度呈梯度的组成型启动子、替换质粒pGro7上的诱导型启动子araB
o|p,得到7种组成型质粒pGro7/GroES-GroEL和pET-28a(+)/CbADH双质粒共表达菌株。酶活测定与蛋白电泳结果分别如
表3和
图6所示。
Fig.6 SDS-PAGE analysis of constitutive pGro7/GroES-GroEL and pET-28a(+)/CbADH dual plasmid co-expressed strainsLane M: molecular weight marker;Lane W:whole cell protein;Lane S:supernatant;Lane P:precipitation 图6 组成型改造pGro7/GroES-GroEL和pET-28a(+)/CbADH双质粒共表达菌株SDS-PAGE分析 |
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结果显示,组成型质粒pGro7和pET-28a(+)双质粒共表达菌株的CbADH酶活与可溶性表达均随着启动子强度提高而提高。其中,菌株M的酶活达到了21.79U/mg DCW,是菌株A菌株的约1.95倍,是出发菌株的约9.43倍,通过灰度分析,其可溶性表达较出发菌株提高了8.07倍。菌株M~S的分子伴侣表达量处于单质粒共表达策略与基因组强化策略之间,而酶活高于这两种策略。
2.6 分子伴侣GroES-GroEL的表达量与CbADH酶活的关系
为探究分子伴侣GroES-GroEL的表达量与CbADH酶活的关系,通过ImageJ软件对蛋白电泳结果进行灰度分析获得全细胞蛋白中GroEL与CbADH的比例,以此为横坐标,以CbADH的酶活为纵坐标对各个菌株的酶活和蛋白表达结果进行作图,如
图7所示。
Fig.7 Relationship between GroES-GroEL expression and CbADH activity图7 GroEL与CbADH表达量比例同CbADH酶活的关系 |
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图7的结果表明,在GroEL占比低时,CbADH酶活随着GroEL占比的提高而上升;当GroEL占比超过一定值时,CbADH酶活随着GroEL占比的提高而下降。在本研究采用的4种表达策略所获得的菌株中,组成型改造pGro7/GroES-GroEL和pET-28a(+)/CbADH双质粒共表达的菌株M的CbADH酶活最高,其GroEL/CbADH的值为0.71,这可能是伴侣蛋白GroES-GroEL与CbADH的最佳表达量之比。
3 结论
通过引入分子伴侣提高了NADPH依赖型醇脱氢酶CbADH的可溶性表达,发现分子伴侣GroES-GroEL对CbADH的可溶性表达影响显著。此外,通过四种不同的GroES-GroEL与CbADH共表达策略,获得了分子伴侣蛋白与目标酶蛋白不同的表达量和表达比例,结果发现分子伴侣GroES-GroEL的表达量过高和过低均不利于提高目标酶CbADH酶活。在本实验所构建的菌株中,组成型改造pGro7/GroES-GroEL和pET-28a(+)/CbADH双质粒共表达菌株M的酶活最高,其GroEL和CbADH的表达量比值为0.71,CbADH的可溶性表达较出发菌株提高了8.07倍,酶活达到了21.79U/mg DCW,是出发菌株的约9.43倍。虽然共表达分子伴侣策略对提高CbADH可溶性表达的效果明显,但分子伴侣的表达或多或少会占用细胞用于表达目标酶蛋白的资源,导致目标酶表达量减少,因此,未来的研究可以直接对CbADH进行蛋白质工程改造,避免目标酶表达量下降的同时提高其可溶性表达,以进一步提升CbADH的酶活。
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