Progress in the Application of Non-immunoglobulin Scaffolds

doi:10.13523/j.cb.20160213

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China Biotechnology ›› 2016, Vol. 36 ›› Issue (2) : 90-95. DOI: 10.13523/j.cb.20160213

Progress in the Application of Non-immunoglobulin Scaffolds

LI Geng, LIU Xiao-zhi, WANG Zhi-ming, GAO Jian

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Abstract

Compared with the antibody drugs, the non-immune globulin scaffolds with a small molecular weight, do not need to be modified after translation, usually lack disulfide bonds, and can undergo straightforward multimerization. In recent years, the development of non-immune globulin scaffolds have reached more than 20 different types, such as Adhirons, Alphabodies, Centyrins, Pronectins, Repebodies, Affimers, and Obodies. 102 proteins have been specifically targeted by 139 different non-Ig scaffold binders. These non-immune globulin scaffolds are used for the treatment and diagnosis of cancer and inflammatory diseases, and there are more than 10 types of non-immune globulin scaffolds have been used in clinical trials. Recently, non-immune globulin scaffolds have also been used in research as structure determination chaperones, which are used in the study for intracellular monitoring of post-translational modifications or as an alternative to antibodiesfor microscopy, flow cytometry, and Western blotting, and so on.

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Biotechnology / Antibody alternatives / Non-immunoglobulin scaffolds

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LI Geng, LIU Xiao-zhi, WANG Zhi-ming, GAO Jian. Progress in the Application of Non-immunoglobulin Scaffolds[J]. China Biotechnology, 2016, 36(2): 90-95 https://doi.org/10.13523/j.cb.20160213

目前多种神经系统疾病常伴有脱髓鞘或髓鞘再生缺陷。髓鞘包裹轴突形成绝缘膜,保证神经冲动沿轴突快速传导^[1,2,3,4];并为神经元提供营养和代谢支持^[5,6,7,8,9]。髓鞘缺失时,动作电位传导减弱甚至中断,从而引发脱髓鞘相关疾病。病患表现为肢体无力、共济失调、意识障碍等,有时可产生急性症状,如强直痉挛和疼痛不适等。

少突胶质前体细胞特化形成少突胶质细胞(oligodendrocyte, OL),OL的主要功能是形成髓鞘^[10];神经活动通过影响OPC的增殖分化及髓鞘形成和再生而引发髓鞘变化^[11,12,13]。少突胶质细胞是出生后中枢神经系统血管生成的关键调节因子之一,而OPC也可参与调节出生后髓鞘形成的起始和白质中血管系统的建立^[14]。

二甲双胍是一种双胍类药物,用于治疗2型糖尿病,可显著降低血糖^[15,16],在抗炎、抗氧化、抗癌、神经保护等方面也发挥重要作用^{[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25]}。因其可激活脑中内源性干细胞,促进神经再生,二甲双胍在神经退行性疾病研究中得到广泛运用。

二甲双胍可影响髓鞘再生,实现神经修复。研究证实,在EAE动物模型中,二甲双胍可通过激活mTOR/AMPK信号通路,使神经营养因子水平升高,诱导并加速髓鞘再生^[26,27]。Neumann等^[28]、Cosgrove等^[29]和Cantuti-Castelvetri等^[30]发现,二甲双胍可使老年鼠OPC恢复活力,促进脱髓鞘损伤后髓鞘再生。但是,二甲双胍如何影响OPC的分化及其内在机制,目前还不清楚。

因此,我们在构建少突胶质前体细胞体外直接分离培养体系的基础上^[31],利用生化与分子生物学等技术手段,研究二甲双胍在OPC分化中的作用,并初步探讨其调控机制,这将为神经系统中髓鞘相关疾病的临床治疗提供理论依据和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)二甲双胍购自Selleck公司(中国);细胞培养因子N2、B27,DMEM/F12培养基购自Gibco公司(美国);胎牛血清、0.25%/0.05%胰蛋白酶购自BI公司(以色列);生物素、胰岛素、多聚赖氨酸、谷氨酰胺、青霉素-链霉素、Triton X-100、三碘甲状腺氨酸购自Sigma公司(美国);牛血清白蛋白购自上海翊圣公司(中国);PDGFRα-AA、bFGF等细胞添加物购自Peprotech公司(美国)。

(2)一抗:OLIG2购自Millipore公司(美国);PDGFRα购自BD公司(美国);MBP、ALDH1L1购自Abcam公司(英国);MAG购自Proteintech公司(美国);GFAP购自Dako公司(丹麦);ACTIN购自Abclone公司(美国);PDGFRα、p-ERK、ERK、p-MEK、MEK、RAS、p-FoxO3a、FoxO3a购自CST公司(美国);荧光标记二抗购自Jackson公司(美国)、Trizol购自Invitrogen公司(美国);抗荧光淬灭封片剂购自上海碧云天公司(中国)。反转录试剂盒购自全式金公司(中国)、qRT-PCR试剂盒购自康为世纪公司(中国)等。

(3)细胞培养箱购自Thermo fisher公司(美国,型号SeriesⅡ WJ);制冰机购自Panasonic公司(日本,型号SIM-F140ADL);Milli-Q纯水仪购自Merck公司(德国,型号Milli-Q Biocel);qRT-PCR仪购自Agilent公司(美国,型号Stratagene Mx3005P);PCR仪购自杭州博日公司[中国,型号TC-96/G/H(b)B];蛋白质电泳系统购自Bio-Rad公司(美国,型号MyCycler);多功能酶标仪购自Tecan公司(瑞士,型号IM200);全自动洗片机购自Eastman Kodak公司(美国,型号Medical X-ray processor 102);倒置激光共聚焦显微镜购自PerkinElmer公司(美国,型号UltraVIEW VOX);分光光度计购自Implen公司(德国,型号Nanophotometer P330);BD流式细胞仪(美国,型号FACSCalibur)等。

1.2 方法

1.2.1 分离和培养少突胶质前体细胞

分别用IgG、IgG/IgM包被细胞培养皿,置于4℃孵育;第二天去除二抗,洗涤后分别用GalC、O4孵育培养皿,室温3 h后备用。剥离C57BL/6新生小鼠(P3)的大脑皮层,洗涤后剪碎组织置于papain溶液中消化20 min,而后获得单细胞悬液依次置于抗体GalC、O4包被的培养皿中孵育1~2 h。培养皿上的细胞经PBS洗涤、胰蛋白酶消化后重悬平铺于细胞板(多聚赖氨酸包被)中,37℃培养箱孵育1~2 h后替换为增殖培养基继续培养,隔天半换液。或次日换为分化培养基,进行后续化合物处理。

1.2.2 免疫荧光染色

OPC经二甲双胍处理48 h后,弃去培养基后用缓冲液洗涤3次,加入2%多聚甲醛固定5~10 min,洗涤3次后加入封闭液孵育1 h,吸走上清,加入一抗溶液,放入4℃冰箱孵育;次日洗涤3次后,加荧光二抗溶液,1~2 h后用PBS洗涤3次,而后加Hoechst溶液染色10 min左右;洗涤后可将细胞爬片取出,倒扣于抗荧光淬灭剂上,封片后使用激光共聚焦显微镜分析。一抗稀释比例:PDGFRα(BD, 1∶1 000)、OLIG2(1∶1 000)、MBP(1∶1 000)。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR检测mRNA表达量

细胞经二甲双胍处理后,加入Trizol溶液(500 μL/孔)后震荡裂解细胞,而后加三氯甲烷(100 μL/孔),充分混匀后静置10~15 min,13 000 r/min低温离心10~15 min,上层水相转移至含异丙醇(500 μL)的新EP管中,混匀后静置10~30 min,13 000 r/min低温离心15 min,沉淀用75%乙醇洗涤后于4℃下13 000 r/min离心15 min,倒去上清后室温静置3~5 min晾干,加入10~20 μL 无酶无菌水溶解。检测样品RNA浓度和纯度后,取0.5~1 μg进行反转录合成cDNA(操作参考全式金公司反转录试剂盒说明书)。实时荧光定量检测步骤参照试剂盒说明书(康为世纪),引物序列见表1。

Table 1 qRT-PCR primers

表1 qRT-PCR引物序列

Name	Sequence (5'-3')
Mag-Fp	CTGCCGCTGTTTTGGATAATGA
Mag-Rp	CATCGGGGAAGTCGAAACGG
Mbp-Fp	GACCATCCAAGAAGACCCCAC
Mbp-Rp	GCCATAATGGGTAGTTCTCGTGT
Olig2-Fp	GGGAGGTCATGCCTTACGC
Olig2-Rp	CTCCAGCGAGTTGGTGAGC
Sox10-Fp	ACACCTTGGGACACGGTTTTC
Sox10-Rp	TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT
Gfap-Fp	CGGAGACGCATCACCTCTG
Gfap-Rp	AGGGAGTGGAGGAGTCATTCG
β-actin-Fp	GGCTGTATTCCCCTCCATCG
β-actin-Rp	CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

1.2.4 Western blot检测

200 μL细胞裂解液中添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(100×),加入细胞中裂解,低温静置30 min后转移至EP管中,震荡离心,BCA法测定蛋白质浓度后加loading buffer置于99℃金属浴10 min。样品进行蛋白质电泳和转膜,NC膜置于封闭液(5%牛奶)中1~2 h,洗膜后加一抗(OLIG2等)孵育,第二天NC膜经TBST洗涤后加HRP标记的二抗孵育1~2 h,TBST洗涤3次后显影定影检测。一抗稀释比例:OLIG2(1∶1 000)、MBP(1∶2 000)、GFAP(1∶20 000)、MAG(1∶2 000)、ALDH1L1(1∶1 000)、ACTIN(1∶2 000)、pERK(1∶500)、ERK(1∶1 000)、pMEK(1∶400)、MEK(1∶1 000)、RAS(1∶1 000)、pFoxO3a(1∶1 000)、FoxO3a(1∶1 000)。

1.2.5 细胞活力检测

按CCK8试剂盒说明书操作,原代少突胶质细胞培养基中加不同浓度二甲双胍处理48 h后,加入CCK8试剂孵育约10 min,使用酶标仪检测450 nm下的OD值变化。

1.2.6 流式细胞分析

细胞经二甲双胍处理后,转移至流式管中,2 000 r/min离心5 min,弃上清,加入2%多聚甲醛室温固定10 min,2 000 r/min离心5 min后弃上清,PBS重悬清洗一次,加入一抗室温孵育1 h,加入PBS洗涤,2 000 r/min离心5 min,加入荧光二抗溶液,室温孵育30 min,加入PBS洗涤,2 000 r/min离心5 min弃上清,最后加入300 μL PBS重悬细胞,细胞悬液进行流式细胞分析。一抗稀释比例:PDGFRα(CST, 1∶500)。

1.2.7 数据分析

采用Excel软件和GraphPad Prism 8.0分析,差异检验使用双尾学生t检验,标注平均值±标准误(SEM),统计显著性阈值标记用* P<0.05、 ** P<0.01、*** P<0.001标注。

2 结果

2.1 构建少突胶质前体细胞体外分离培养体系

密度梯度法、震荡分离纯化等常用方法获取的OPC纯度不高且周期长,本文采用抗体免疫吸附法直接分离新生鼠OPC(图1a),加增殖培养基48 h后,利用免疫荧光染色检测细胞纯度和形态,用PDGFRα、OLIG2双标指示OPC,结果显示双阳性细胞比例高达90%以上,原代OPC纯度较高(图1b)。

Fig.1 Isolation and cultivation of oligodendrocyte precursor cells

(a) Flowchart showing the isolation and cultivation of OPC in vitro (b) Immunofluorescence labeling of PDGFRα (red) and OLIG2 (green) in cultured cells

图1 少突胶质前体细胞体外分离培养

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2.2 二甲双胍对OPC的影响

为确定药物处理浓度,使用少突胶质细胞系Oli-neu或OPC检测不同浓度二甲双胍对细胞活性的影响。Western blot结果显示,300 μmol/L、900 μmol/L高浓度二甲双胍处理,细胞状态不佳,OLIG2、ALDH1L1、GFAP等蛋白质量明显降低,药物有毒性(图2a、b)。CCK8检测结果显示,二甲双胍浓度在100 μmol/L左右对细胞活性无显著差异,可作为细胞处理浓度(图2c)。

Fig.2 Effect of metformin on cell viability and protein expression

(a) Western blot analysis of MAG, ALDH1L using indicated antibodies in Oli-neu cells after metformin (0, 100 μmol/L, 300 μmol/L, 900 μmol/L) treatment for 48 h (b) Western blot analysis of OLIG2, MBP, ALDH1L1, GFAP in OPC after metformin treatment for 48 h (c) CCK8 assay showed relative cell viability in OPC after metformin treatment

图2 二甲双胍对细胞活力和蛋白表达的影响

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2.3 二甲双胍促进OPC分化

选用100 μmol/L二甲双胍处理原代细胞以检测其对OPC分化的影响。免疫荧光染色结果显示:二甲双胍处理后,PDGFRα⁺OLIG2⁺双阳性的OPC数量较对照组显著增加(图3a、b)。流式细胞分析结果显示:二甲双胍处理原代细胞后, PDGFRα阳性细胞数显著高于对照组(图3c~e)。免疫荧光染色发现,分化条件下二甲双胍处理原代细胞后,MBP标记的OL数量相较于对照组显著增加(图3f、g)。收集细胞提取RNA、准备蛋白质样品分别进行qRT-PCR、Western blot检测,结果表明,经二甲双胍处理后,少突胶质细胞谱系分化相关基因Mag、Mbp、Olig2、Sox10的mRNA水平显著增加,星形胶质细胞标记基因Gfap mRNA水平变化不明显(图3h);OPC分化相关蛋白质OLIG2、MBP的量逐渐增加,星形胶质细胞蛋白ALDH1L1和GFAP无变化(图3i)。这表明二甲双胍促进OPC分化。

Fig.3 Metformin modulates OPC differentiation

(a) Immunofluorescence labeling of PDGFRα (green) and OLIG2 (red) in cells after 100 μmol/L metformin treatment for 48 h (b) Quantification of the percentage of PDGFRα⁺OLIG2⁺ cells *** P< 0.001 (c),(d) Flow cytometry analysis of PDGFRα in living cells after 100 μmol/L metformin treatment for 48 h (e) Quantification of the percentage of PDGFRα⁺ cells *** P<0.001 (f) Immunostainings of MBP (green) in cells treated with metformin for 48 h (g) Quantification of MBP⁺ cells *** P<0.001 (h) The mRNA levels of Mag, Mbp, Olig2, Sox10 and Gfap in primary cells after 100 μmol/L metformin treatment n=4 each group, * P< 0.05, ** P<0.01 (i) Western blot analysis of protein levels (OLIG2, MBP, ALDH1L1, GFAP) in OPCs treated with metformin for 48 h

图3 二甲双胍促进OPC分化

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2.4 二甲双胍促进OPC分化的分子机制

为解析二甲双胍促进OPC分化的分子机制,我们使用少突胶质细胞系Oli-neu开展实验。二甲双胍处理细胞0 min、5 min、10 min和30 min后,收集蛋白质样品进行Western blot检测,细胞经二甲双胍处理5 min后, RAS-MEK-ERK信号通路中关键蛋白质p-MEK、p-ERK及RAS表达量骤增(图4a)。进一步在原代OPC中验证,结果显示,经二甲双胍处理5 min后,关键蛋白质p-MEK和p-ERK表达量增加, p-MEK/MEK和p-ERK/ERK值升高,与Oli-neu的实验结果一致(图4b、c)。这提示,二甲双胍可能通过RAS-MEK-ERK信号通路促进OPC分化(图4d)。

Fig.4 The mechanism of metformin modulating OPC differentiation

(a) Immunoblotting analysis of RAS, p-MEK, MEK, p-ERK, ERK protein levels in Oli-neu cells after metformin treatment for 0, 5, 10 and 30 min (b) Immunoblotting analysis of the protein expression in OPC after metformin treatment for 5 min (c) Quantification of protein expression * P<0.05, *** P<0.001 (d) The model depicts the role and mechanism of metformin in oligodendrocyte precursor cell differentiation

图4 二甲双胍促进OPC分化的机制

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3 讨论

髓鞘缺失引发脱髓鞘相关疾病,如视神经脊髓炎(NMOSD)、多发性硬化症(MS)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿尔茨海默病(AD)和亨延顿病(HD)等^{[31,32,33,34,35]}。

但是,目前此类疾病还没有行之有效的治疗措施和药物。因此,研究如何增加成髓鞘细胞的数量促进髓鞘发生,对脱髓鞘相关疾病的治疗和药物研发具有重要的研究意义。

OL是中枢神经系统中一群特化的胶质细胞,其主要功能是形成髓鞘,传递神经信号。OL是由少突胶质前体细胞分化成熟而来的。以往研究中,常使用密度梯度法、震荡差速贴壁法、神经干细胞诱导分化等方法获取OPC,但往往存在细胞纯度不高、培养周期长、与体内细胞状态差异较大等缺点。本文通过抗体免疫吸附法构建OPC体外分离培养体系,可获得纯度较高、更接近体内正常生理状态的原代细胞,且明显缩短了细胞培养周期。

研究证实,二甲双胍在多发性硬化症(MS)等神经系统疾病的动物模型中具有神经保护和抗炎作用^{[16, 36-38]}。二甲双胍参与细胞分化的信号通路有AMPK、mTOR等。据报道,AMPK信号通路调控细胞增殖和能量代谢,提高细胞抗氧化防御^[39]。Houshmand等^[27]发现,二甲双胍可能通过神经营养因子BDNF、CNTF和NGF的表达,下调NogoA的表达,诱导活化AMPK,促进成熟少突胶质细胞在胼胝体中的增殖。mTOR信号通路调控细胞生长,二甲双胍降低Th17数量,通过mTOR/HIF-1α促进成熟OL增殖和髓鞘再生,对少突胶质细胞损伤起保护作用^[40]。本文机制研究发现,二甲双胍通过RAS-MEK-ERK信号通路促进OPC分化。此外,我们还发现Oli-neu经二甲双胍处理后,p-FoxO3a表达在5 min、10 min时表达量增加,而FoxO3a无明显变化。这提示了p-FoxO3a也可能参与少突胶质细胞分化调控(图5)。

Fig.5 Effect of metformin on oligodendrocytes

Western blot analysis of p-FoxO3a, FoxO3a expression in cells after 100μmol/L metformin treatment for 0, 5, 10 and 30 min

图5 二甲双胍调控少突胶质细胞分化

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虽然已发现二甲双胍在改善MS病人脱髓鞘病症方面的作用,但其具体机制还不清楚,且二甲双胍在其他髓鞘相关疾病中的作用也不明确。为此,本文在构建少突胶质前体细胞体外分离培养体系的基础上,运用生化与分子生物学、细胞生物学等技术手段,阐明二甲双胍对少突胶质前体细胞分化的影响,并初步探讨其分子机制,为二甲双胍在神经系统髓鞘相关疾病临床治疗中的运用提供理论依据,并为药物研发提供新思路。

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Received	Revised	Published
2015-09-11	2015-09-24	2016-02-25
Issue Date
2015-11-19

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