人γ－精浆蛋白的亲和纯化及其糖基化分析

中国生物工程杂志

研究简报

人γ－精浆蛋白的亲和纯化及其糖基化分析

张青张思河苏明权沈建军韦晓明郝晓柯

第四军医大学唐都医院检验科信阳师范学院生命科学学院信阳师范学院生命科学学院信阳师范学院生命科学学院信阳师范学院生命科学学院第四军医大学西京医院检验科

Purification of human γ-seminoprotein by affinity chromatography and glycosylation analysis

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摘要： 目的:从人精液中提纯γ-精浆蛋白并对其生物学特性进行鉴定。方法:应用饱和硫酸铵法从小鼠腹水中纯化出抗γ-精浆蛋白的单克隆抗体E4B7，将其共价交联到CNBr-Sepharose4B上，制备成免疫亲和层析柱，用该层析柱亲和纯化经饱和硫酸铵粗提的精液标本。纯化产物分别用SDS-PAGE、Western-blot及ELISA进行生物学特性鉴定，最后经PNGase F、Endo-H酶消化后进行糖基化分析。结果:SDS-PAGE电泳表明纯化蛋白的相对分子量约为44KD，Western-blot及ELISA鉴定显示该蛋白可与抗γ-精浆蛋白的单抗E4B7特异性结合。对纯化蛋白无论是单用Endo-H酶消化，还是同时用Endo-H酶和PNGase F酶共同消化，消化产物电泳后相对分子量均降低到34KD左右，而单独用PNGase F酶消化后相对分子量没有改变。Western-blot及ELISA鉴定显示糖苷酶处理后的纯化蛋白仍可与单抗E4B7特异性结合。结论:成功纯化出N-糖基化形式的γ-精浆蛋白，这为下一步筛选人源化抗体奠定了纯的抗原基础。

关键词： 糖基化; γ-精浆蛋白; 亲和层析

Abstract: Objective To purify and identify γ-seminoprotein from human seminal plasma and analyze the glycosylation form. Methods The mAbE4B7 against humanγ-seminoprotein were firstly purified from mice ascites by saturated ammonium sulfate precipitation, and then coupled to CNBr-Sepharose4B as the Ligand for generation of immuno-affinity chromatography column. The sperm derived from health people were primly purified by saturated ammonium sulfate precipitation, and then employed to the immuno-affinity chromatography column. The purified production was treated respectively with peptide N-glycosidase F (PNGase F) and Endo-β-N-acetylglucosaminidaseH (Endo-H) deglycosylated enzyme. The resultant productions were identified by SDS-PAGE, Western-blot and ELISA analysis respectively. Results The purified protein with a band of molecular mass 44KD were got in SDS-PAGE, and it bind specifically to mAbE4B7 in Western-blot and ELISA assay. The molecular mass of the purified protein was recovered to be 34KD with the treatment of deglycosylated enzyme Endo-H alone, or both Endo-H and PNGase F. Whereas there is no molecular mass change by treating with PNGase F alone. The deglycosylated production also bind specifically to mAbE4B7 in Western-blot and ELISA assay. Conclusion specificγ-seminoprotein with correct N-glycosylation are successfully isolated and purified. This purified seminoprotein provides a good antigen basis for humanization of mAbE4B7 by guide-selection technology.

Key words: glycosylation γ-seminoprotein affinity chromatography

收稿日期: 2006-08-07 出版日期: 2007-02-25

通讯作者: 郝晓柯

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张青,张思河,苏明权,沈建军,韦晓明,郝晓柯. 人γ－精浆蛋白的亲和纯化及其糖基化分析[J]. 中国生物工程杂志, .

. Purification of human γ-seminoprotein by affinity chromatography and glycosylation analysis. China Biotechnology, .

链接本文:

https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/ 或 https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2007/V27/I2/99

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