抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

周敏 石必枝 顾健人 李宗海

中国生物工程杂志 ›› 2010, Vol. 30 ›› Issue (04) : 1-7.

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中国生物工程杂志 ›› 2010, Vol. 30 ›› Issue (04) : 1-7.
技术与方法

抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

  • 周敏,石必枝,顾健人,李宗海**
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Construction and Screening of Phage Antibody Libraries Against Epidermal Growth Factor Receptor Variant Type III

  • ZHOU Min,SHI Bi-zhi,GU Jian-ren,LI Zong-hai
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摘要

目的：应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш (epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ, EGFRvIII)的单链抗体 (single chain Fv, scFv)。方法：利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠，扩增VH和VL片段并拼装成scFv 基因，连接至噬菌粒pCANTAB 5E，电击转化Hpd3cells，构建噬菌体单链抗体库，并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时，采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析，转化E.coli HB2151，IPTG 诱导可溶性scFv 的表达。结果：构建了库容为7.9×107 的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选，得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明，该抗EGFRvIII scFv 基因序列长807 bp，编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv 可分别与纯化的EGFRvIIIex抗原以及细胞表面的EGFRvIIIex结合。结论：利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvIII scFv，为开发针对EGFRvIII的抗体药物提供了靶向载体分子。

Abstract

Objective: To construct a phage display library of single chain variable fragment (scFv) antibodies and to screen a scFv antibody against epidermal growth factor receptor variant type III (EGFRvIII). Method: Balb/c mice were immunized by recombinant EGFRvIIIex and NIH3T3/EGFRvIIIex cell line. Genes of variable heavy (VH) and variable light (VL) chains of antibodies were prepared by RT-PCR from the splenic cells of immunized mice and further artificially joined with a flexible peptide linker, then ligated into the phagemid vector pCANTAB 5E. The phagemides containing scFv were transformed into electrocompetent Hpd3cells. The recombinant phages were enriched through 3 rounds of affinity panning and the anti-EGFRvIII phage scFv clones were identified by ELISA. The fourth round of panning performed at a higher stringency of selection, which used a capture concentration of 0.5μg or 0.05μg. After identified by ELISA, one positive clone was sequenced and transfected into E.coli HB2151 cells to express. Result: A phage display library with a complexity of approximately 7.9×107 was constructed. After the fourth round of panning performed at a increasing stringency of selection, higher affinity clones were obtained. Sequencing analysis showed that the anti-EGFRvIII scFv was 807 base pairs coding 268 amino acids. The soluble scFv exhibited the binding activity to purified recombinant EGFRvIIIex protein and EGFRvIII overexpression cell line. Conclusion: The successful preparation of anti-EGFRvIII scFv will provide an EGFRvIII targeted molecule for the development of antibody-based drugs.

关键词

表皮生长因子受体突变体Ш / 噬菌体抗体库 / 单链抗体

Key words

Epidermal growth factor receptor variant type III / Phage antibody library / Single chain antibody

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周敏 石必枝 顾健人 李宗海. 抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选[J]. 中国生物工程杂志, 2010, 30(04): 1-7
ZHOU Min, DAN Bi-Qi, GU Jian-Ren, LI Zong-Hai. Construction and Screening of Phage Antibody Libraries Against Epidermal Growth Factor Receptor Variant Type III[J]. China Biotechnology, 2010, 30(04): 1-7
随着经济的发展和人口的增加,人类对非可再生能源的过度开采已成为地球不能承受之重。工农业废水、固体废弃物、城市垃圾渗滤液等造成的水污染、土壤污染严重威胁人类健康,这些污染物的处理耗费巨大。开发和利用可再生清洁能源是解决能源和环境问题的关键所在,也是走可持续发展道路的战略抉择。
微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC)是一种利用微生物将有机物中的化学能直接转化成电能的装置,主要由阳极室、阴极室、分隔膜和外电路组成。其基本工作原理是:在阳极产电微生物的作用下,有机物发生氧化分解并释放出电子和质子,电子经产电微生物胞外电子传递到阳极表面,而后经外电路到达阴极,同时质子穿过分隔膜由阳极室进入阴极室,在阴极表面发生还原反应。MFC可实现污染治理同步发电,且与其他新能源开发技术相比具有原料来源广泛、常温常压运行、成本低、安全性能好、清洁环保等诸多优势[1]。
早在1911年,英国植物学家Potter将铂电极放在大肠杆菌和酵母菌培养液中,发现可以产生电流,并在此基础上提出了MFC的概念[2],但由于其产电效率太低,这一研究成果长期未受到重视。20世纪80年代,由于电子传递中间体的广泛应用,MFC的输出功率有了较大提高[3],但对于进一步的应用来说仍显得过于昂贵和不切实际。1999年后,研究人员陆续发现了可与固体电极直接进行电子传递的产电微生物,这些微生物包括但不限于地杆菌属(Geobacter)[4,5]、希瓦氏菌属(Shewanella)[6,7]、梭菌属(Clostridium)[8]和假单胞菌属(Pseudomonas)[9]。基于这些产电微生物制造了无介体MFC,即直接MFC,也由此开辟了MFC领域的研究热点之一:产电微生物胞外电子传递机制[10,11,12]。近年来,MFC领域的发文量迅速增长,研究内容主要关注其在污水及剩余污泥处理、生物修复、环境监测、传感器等方面的应用[13,14,15]。然而,目前这些研究仍处于实验室阶段,MFC输出功率距离真正投入生产实践还有较大距离,如何提升MFC的产电能力是研究人员普遍关注的重要课题。我国作为人口大国,面临的能源和环境问题尤为严峻,在清洁能源开发和污染治理方面投入较大。近年来,我国MFC研究发展迅速,产生了一批具有坚实工作基础的MFC研究中心,如清华大学环境科学与工程系主要从事“三合一”MFC的产电特性研究,中国科学院过程工程研究所在硫还原泥土杆菌(Geobacter metallireducens)异化还原铁氧化物方面卓有成效,哈尔滨工业大学市政环境工程学院主要关注废水生物处理与生物燃料电池发电[16,17,18]。
科技论文和专利分别是基础研究成果和技术创新成果的重要指标,二者都是科学技术发展过程中重要的知识载体,蕴含着丰富的科技情报信息。对论文和专利进行统计分析和文本挖掘有助于把握技术的发展态势,为科研布局和战略规划提供依据和参考。本文通过对MFC领域的论文和专利数据综合进行分析,揭示MFC的发展趋势、国际分布、技术领域和研究热点,并在此基础上对MFC领域的发展提出思考和建议。

1 数据来源与方法

1.1 数据来源

本文对MFC相关论文和专利进行检索与分析。文中论文数据来自科睿唯安公司的Web of Science核心合集。专利数据来自德温特专利检索分析平台(Derwent Innovation, DI),利用主题词及国际分类号(IPC)进行组合设计检索策略,检索日期为2019年5月22日。由于专利公开存在18个月的滞后期,2017年和2018年的专利数据不全,仅供参考。

1.2 方 法

本文利用分析工具TDA(Thomson Data Analyzer)进行数据清洗和分析,通过专利检索分析平台DI绘制专利地图,揭示MFC的研究技术领域分布。采用LDA模型进行论文研究主题识别,选取标题、摘要和作者关键词字段构建语料库。

2 结果讨论

2.1 发文量及专利申请量年度变化趋势

2.1.1 发文量年度变化趋势 1990~2018年全球共发表MFC相关论文10 511篇,其中中国发文量2 866篇,占27.27%。以2006年为界,全球发文量分为缓慢发展期和快速发展期两个阶段(图1)。根据国际能源署发布的国际原油价格数据,2005年原油价格猛涨,约比2004年增长50%,由此引发煤炭、天然气和电力价格高涨,使人们更注重可再生能源的开发利用和节能方式的研发,推动了MFC的研究。
图1 1990~2018年MFC领域发文量年度变化趋势

Fig.1 The annual distribution of MFC publications from 1990 to 2018

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中国第一篇MFC领域的研究论文发表于1995年,过去十年发文量年均增长率为24.92%,总体发展趋势与全球趋势大致相同。
2.1.2 专利申请量年度变化趋势 1990~2018年全球MFC领域共申请专利2 614项(按照DWPI同族专利合并)。由图2可以看出,2006年以前,MFC专利申请量缓慢增长,2006~2011年进入“第一快速发展期”,2012年申请量显著下滑,2013年后又进入“第二快速发展期”,2015年之后呈现波动中上升趋势。
图2 1990~2018年MFC领域专利申请量年度变化趋势

Fig.2 The annual distribution of MFC patent applications from 1990 to 2018

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中国MFC领域专利申请量年度变化趋势与全球趋势总体一致,有所不同的是2006~2011年连续增长,没有短暂的平台期(图2中箭头处)。

2.2 各国研发能力对比分析

2.2.1 研究论文产出分析 从论文产出分布看,MFC研究主要集中于东亚、南亚、北美洲和西欧。从论文总量来看,中国和美国的发文量持平且遥遥领先于其他国家和地区,是位列第三的印度的发文量的3.63倍。
从被引频次看,中国在MFC领域发表论文的篇均被引频次为21.76,在发文量排名前20位的国家中位列倒数第二(图3)。澳大利亚、荷兰、比利时等国家虽然发文量较低,但篇均被引频次较高。由此可见,我国在MFC领域虽然论文总量多,但高被引论文占比较少,论文质量有待提升。
图3 发文量排名前20国家的论文数目及篇均被引频次

Fig.3 Publication numbers and citations per paper of Top20 countries

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2.2.2 专利产出分析 全球共有33个国家和地区受理了MFC专利申请,其中中、日、美、韩四国MFC专利拥有量均在100项以上,是主要的技术来源国家。中国以1 352项专利位居全球之首,约为日本的3.23倍、美国的3.56倍。整个非洲及南美洲分别只有南非和巴西各2件专利,尽管南美洲巴西、阿根廷以及非洲的沙特阿拉伯等国在MFC领域的发文量比较可观,但这在一定程度上反映了这些国家的科技成果转化能力和专利保护意识相对薄弱。
MFC专利申请主要集中在本国,少部分提交至世界知识产权组织(WO)和欧洲专利局(EP),导致主要技术来源国与主要技术市场国趋于一致。以中国为例,1 352项专利中有1 338项是在本国申请,占98.96%。呈现这种现象的原因在于目前MFC研发大多处于实验室阶段,真正能够投入生产实践并带来经济效益的技术产品很少,主要技术研发国家很少在除本国以外的区域进行专利布局。
从专利被引频次来看,中国MFC领域被引频次在10以上的专利占比仅为6.07%,远低于日本(13.60%)和美国(41.58%)(表1),说明中国在MFC领域高被引专利与发达国家相比还有一定差距。
表1 排名前4位的国家的专利数量及被引频次

Table1 Patents numbers and citations of Top4 countries

序号 国家 专利数目 总被引
频次		 被引频次
大于10的
专利数目		 被引频次大于
10的专利累
计被引频次
1 中国 1 352 3 147 82 1 290
2 日本 419 2 068 57 1 376
3 美国 380 8 711 158 8 104
4 韩国 178 564 8 378

2.3 主要研究机构分析

1990~2018年总发文量排名前10的机构中,中国有6个,合计发文量1 456篇,占MFC领域总发文量的13.85%,其中中国科学院以471篇的发文量排名第一(图4a)。专利申请量排名前10的专利权人中,高校和科研院所共7个,均隶属于中国,企业有3个,均为日本公司,其中索尼公司拥有的专利数量位居第一(图4b)。
图4 MFC发文量前10研究机构(a)及专利申请量前10专利权人(b)

Fig.4 Top10 organizations of publications (a) and Top10 assignees for MFC (b)

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进一步对专利申请排名前10的国家(Top10)在MFC领域专利权人构成情况进行统计分析(图5),其中企业、高校、科研院所、政府机构/基金会分别占44%、40%、13%和3%(排除个人为专利权人的数据)。
图5 MFC领域专利权人组成结构

Fig.5 Analysis on the composition of assignees in the MFC field

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与此相比,专利申请量最多的四国中,中国和韩国的研发主体主要是高校和科研院所,美国和日本的MFC研发则以企业为主,其中日本的专利权人中企业占比高达74%,而中国专利权人中企业占比仅为30%。

2.4 重点技术领域分析

2.4.1 基于专利IPC分类号的技术领域构成分析 IPC的分类统计可以显示出MFC研发重点技术领域构成,由此可以揭示研发的重点和热点。我们分析了MFC领域IPC分类情况,并列出了排名前10位的IPC代码及其技术来源国家。由表2可以看出,H01M类别为MFC专利中占比最大的部分,约82.7%,可见绝大部分MFC专利均为电池基础研究,包括制造方法、电池结构的改进、电极材料的选择、电池组成部分的设计和优化等。其次是C02F,涉及污水或污泥处理,这也是MFC最主要的应用领域。C12N、C12M、C12Q、C12R和C12P类别均与酶或微生物有关,主要涉及产电微生物的分离培养、菌种开发、菌群生态优化、基因改造和酶生物燃料电池相关内容。G01N类别是借助于材料的理化性质测试或分析材料,包括阴极、阳极材料或离子交换膜等。C25B类别专利关于MFC电解产氢、产甲烷,B01J类别与催化剂相关。从IPC分布可以看出,目前致力于产电性能提高的基础研究是MFC研究的主要内容,污水或污泥处理是MFC的主要应用领域。
表2 MFC重点技术领域分布及主要技术来源国家

Table 2 Main technical distribution and source countries of MFC technology

序号 IPC 涉及技术领域 专利数量 主要技术来源国家
1 H01M 直接转变化学能为电能的方法或装置 2 162 中国、日本、美国
2 C02F 水、废水、污水或污泥的处理 737 中国、日本、韩国
3 C12N 微生物或酶;其组合物 227 日本、中国、美国
4 G01N 借助于材料的理化性质测试或分析材料 178 日本、中国、美国
5 C12M 酶学或微生物学装置 105 日本、美国、中国
6 C12Q 包含酶或微生物的测定或检验方法 87 日本、美国、韩国
7 C12R 涉及微生物 76 中国、日本、美国
8 C12P 发酵或使用酶的方法合成目标化合物 72 美国、中国、日本
9 C25B 生产化合物或非金属的电解工艺或电泳工艺;其所用的设备 72 中国、美国、日本
10 B01J 化学或物理方法,如催化作用 60 中国、日本、美国
对主要技术来源国家进行MFC技术构成分析(图6),可以看出中、日、美、韩四国投入最多的方面均为致力于MFC产电能力提高的基础研究(H01M),MFC在污水、污泥处理领域(C02F)的专利数目以中国最多,占全球MFC污水、污泥治理专利总数的76.66%,数量优势较为明显。日本、美国、韩国在其他几个技术领域的投入相对均衡。
图6 MFC主要技术来源国的技术构成分析

Fig.6 Analysis on the technical composition of the main source countries of MFC technology

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2.4.2 基于专利地图的技术领域构成分析 我们进一步通过绘制专利地图的形式挖掘专利文本信息并进行可视化呈现(图7)。由专利地图分析可得,MFC专利主要集中在电极、电极室、催化剂、分隔膜、产电微生物等基础研究(图中方框所示),以及污水处理、剩余污泥处理、脱盐、人工湿地MFC、植入式医疗设备MFC等应用研究方面(图中圆圈所示)。
图7 MFC专利地图

Fig.7 Patent map of MFC

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由图5可以看出,我国MFC研发主要以高校和科研院所为主体,有别于日本、美国等发达国家以企业为主体的研发结构,为进一步了解二者之间研究方向的异同,分别选取全球MFC领域专利申请量排名前3位的研究机构:中国科学院、哈尔滨工业大学、浙江大学,以及排名前3位的公司:索尼、丰田、松下。结合专利地图和专利文献内容分析得出,中国科学院、哈尔滨工业大学和浙江大学的MFC研究领域包括MFC产电效率提高、MFC污水和剩余污泥治理、产电微生物分离培养。日本的三个MFC研发企业则更侧重于MFC在电子产品供电方面的应用,如植入式医疗设备MFC、MFC汽车、MFC传感器,此外还涉及酶电极、催化剂等的研发。
2.4.3 基于LDA模型的研究论文主题识别 由于目前MFC研究仍处于实验室阶段,许多研究成果以科研论文的形式呈现,对科研论文进行文本挖掘对于全面揭示MFC研究的细分领域和热点方向是非常必要的。LDA模型即潜在的狄利克雷分布模型(Latent Dirichlet Allocation Model)是一种经典有效的概率生成模型,包含文本-主题-词三层贝叶斯结构,可以从大规模文档集中挖掘潜在的主题信息[19],在科技文献主题识别中发挥着重要作用。我们以MFC领域1990~2018年的论文数据集构建语料库,利用LDA模型进行主题识别,经过主题过滤及人工判读,从30个主题中识别出24个有效主题,按主题强度排序如表3所示。
表3 MFC论文LDA主题识别结果(K=30)

Table 3 LDA topic identification results of MFC papers

序号 主题内容 主题强度
1 MFC污水处理同步发电 0.088 300 94
2 MFC性能参数及评价指标 0.055 434 09
3 胞外电子传递机制 0.039 419 18
4 MFC生物质能利用 0.037 892 68
5 MFC电解产氢 0.035 797 99
6 MFC电解产甲烷 0.035 279 24
7 MFC结构健康监测 0.034 857 11
8 MFC底物 0.034 700 82
9 MFC还原重金属 0.033 189 93
10 污泥厌氧消化 0.033 006 46
11 沉积物MFC 0.032 229 56
12 阳极生物膜 0.031 433 28
13 MFC脱盐、海水淡化 0.031 208 62
14 脱氮微生物群落结构 0.031 081 72
15 纯菌型MFC/混菌型MFC 0.030 726 48
16 MFC制备 0.030 687 91
17 光合MFC 0.030 620 78
18 石油污染土壤的生物修复 0.029 987 36
19 酶生物燃料电池 0.029 969 62
20 生物传感器 0.029 848 93
21 产电基因工程菌 0.029 818 23
22 产电微生物种群生长数学建模 0.028 980 11
23 分隔膜 0.028 850 97
24 生态修复 0.028 538 58
由表3可以看出,MFC污水治理同步发电的主题强度最高。除污染治理外,MFC在生物质能的利用、可再生清洁能源的生产方面的主题强度也较高,MFC可以实现纤维素、苯系物等复杂有机物的降解,可以制备氢气、甲烷等清洁能源。与专利相比,MFC论文涉及胞外电子传递机制、产电微生物种群生长数学建模等理论研究较多。植入式医疗设备MFC主题则没有出现,说明与此相关的论文较少,研究结果主要以专利的形式呈现,这可能与其研发主体多为企业,更注重实际应用和商业价值有关。

3 结 论

3.1 全球MFC领域发展前景良好,中国MFC发展趋势与全球整体趋势同步

2005年以来,全球MFC领域发文量一路攀升,发展势头强劲。除2012年有短期回落之外,专利申请量也呈快速增长趋势,说明MFC技术发展正处于成长期,世界范围内正在加大对MFC研发的投入,行业整体技术发展前景良好。近年来,我国MFC研究发展迅速,国家对于MFC的研究给予了大力支持,在全球已发表的MFC论文中有10.29%得到中国国家自然科学基金委的资助。从论文发文量及专利申请量的年度变化趋势来看,中国MFC发展趋势与全球整体趋势保持同步,科研产出持续增长。

3.2 MFC研究的技术来源国与技术市场国分布趋于一致

综合论文和专利产出来看,MFC研究主要集中于亚洲的东部和南部、北美洲、西欧。中、日、美、韩既是主要的技术来源国,又是技术市场国。推测形成这种专利分布的原因在于,MFC研发目前仍主要处于实验室阶段,真正投入生产实践的专利技术很少,在全球范围内进行专利布局收益小,专利维护成本高。未来MFC研发进入实际生产阶段,带来显著的经济效益和生态效益,相信MFC的专利市场将会不断扩大。

3.3 产电性能提高依然是MFC研发的重点和热点

根据IPC代码和LDA主题识别结果分析得出,MFC研发的重点和热点依然是致力于产电性能提高的基础研究。提高产电能力的落脚点主要在以下方面:(1)电池构型。MFC从实验室规模放大到实际应用,功率密度会大规模降低,电池构型的改进是解决这一问题的关键因素,目前有单室MFC、双室MFC、“三合一”型MFC以及多阳极、多阴极MFC等构型。(2)电极材料的选择。开发导电性能好、耐腐蚀、比表面积大、价格低廉的导电材料是降低电阻、提高MFC产电能力的关键。(3)质子交换膜。作为MFC的重要组成部分,质子交换膜的主要功能是维持阳极室和阴极室各自的反应环境和二者之间的电势差,将质子高效传递到阴极。质子交换膜的性质直接影响到MFC的工作效率,其偏高的成本也是制约MFC工业化进程的一个重要因素。(4)产电微生物的电子传递效率。目前对产电微生物的电子传递机制了解的尚不十分透彻,进一步阐明胞外电子传递机制有望实现MFC研发的突破性进展。此外,现阶段使用的产电微生物主要包括奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等菌种,只占自然界微生物种类的极小一部分,高效产电菌种的选择、菌群生态优化调控以及对传统菌株进行遗传改造和分离培养是提高MFC产电性能的重要一环。随着研究的不断深入,MFC真正市场化应用指日可待。

3.4 MFC应用以污水治理为主,日益呈现多元化趋势

MFC专利中,污水、污泥治理相关专利(C02F)以737项位居第二,占专利总数的28.19%,是MFC除发电之外最主要的应用领域。近年来,除污水治理之外,MFC的应用日益呈现多元化趋势。植入式医疗设备MFC可以利用人体血液中的葡萄糖等为能源,为人体内的电子装置,如心脏起搏器、生物芯片、体内药物投放装置等稳定持续供电,在医疗领域具有广阔的应用前景[20]。海洋MFC利用海底沉积物所含的有机物和矿物质作为燃料,为在深海、远海中服役的海洋监测设备提供长期稳定的原位电能[21]。植物-MFC是将植物的光合作用与MFC相结合,利用植物的光合作用为MFC源源不断地提供基质,实现了光能到电能的转化,同时可起到改善生态环境的作用,但目前产电能力非常有限,有待于进一步的优化改进[22,23]。相信凭借其安全、无污染、常温常压运行、可持续供电等诸多优势,MFC将在更多的领域产生效用。

3.5 中国MFC论文及专利成果丰硕,质量有待提高

中国在MFC领域的专利申请量位居世界首位,特别是在污水、污泥治理方面,中国的专利数量占全球的76.66%,一定程度上说明我国的MFC研发水平处于世界领先地位。然而,高被引论文和高被引专利相对较少,和发达国家相比还有较大差距。要提升我国在MFC领域的核心竞争力,一方面要发挥我国在MFC进行污水、污泥治理方面的竞争优势;另一方面要重视在植入式医疗设备MFC、传感器等高新技术领域的研发投入,提高论文及专利的质量和国际影响力。

3.6 中国MFC领域研发主体与发达国家显著不同

从专利权人分布看,我国MFC研发主体类型单一,在我国专利拥有量排名前50的专利权人中,全部为高校或科研院所,与日本、美国等发达国家以企业为主体的研发结构形成鲜明对比。这种情况说明我国企业在MFC领域参与度低、竞争力弱,从而导致商业化进程较慢。政府和有关部门要制定相关政策扶持、引导企业积极投入MFC的研发,加大科研院所与企业的合作研发力度,充分发挥市场优势,加速MFC的产业化进程。
MFC作为一种可以实现同步污水处理和电能回收的清洁能源技术,代表了未来废水资源化的发展方向,具有广阔的发展前景。虽然目前MFC的产电能力距实现工程应用还有一定距离,但我们相信随着电池结构的不断优化、电极材料的持续改进以及高电子传递效率的产电微生物的挖掘探索,MFC的产电能力将不断提升,终将在实际生产中发挥重要作用,产生不可估量的经济、环境和社会效益。

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基金

国家“863”计划（2007AA021203）、上海市青年科技启明星计划（07QA14046）资助项目


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