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中国生物工程杂志

CHINA BIOTECHNOLOGY
中国生物工程杂志
中国生物工程杂志  2010, Vol. 30 Issue (03): 90-94    
技术与方法     
REAL-TIME PCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数
李淑洁,张正英**
甘肃省农业科学院生物技术研究所 兰州 730070
Using REAL-TIME PCR to Determine Transgene Copy Number in Wheat
Research Institute of Biotechnology, Gansu Academy of Agricultural Science, Lanzhou 730070, China
 全文: PDF(947 KB)   HTML
摘要：

采用SYBR GreenⅠ real-time PCR方法检测7株转基因小麦中外源半夏凝集素基因的拷贝数。以小麦蜡质基因（wx012）作为内参基因，以未转基因小麦基因组DNA为内参基因标准品进行5倍梯度稀释得到内参基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线：y=-0.2667x+6.98；以含半夏凝集素基因（pta）的质粒DNA为目的基的因标准品同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线：y=-0.2118x+4.53。通过SYBR GreenⅠ real-time PCR分别获得每一样本中目的基因和内参基因的CT值，将CT值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因植株中的拷贝数。计算结果为：单拷贝的有1株，2个拷贝1株，3拷贝和4拷贝的各有2株，其中有1株为假阳性植株。
关键词： SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR;  CT值;  pta;  wx012;  转基因小麦;  拷贝数    
Abstract:

SYBR GreenⅠ real-time PCR was developed to determine the copy number of exogenous pta gene in transgenic wheat. A conserved wheat housekeeping gene, wx012, was used as an internal control and 5 times diluted non-transgenic wheat genome DNA is used as an initial template copy of wx012.So the y=-0.2667x+6.98, the standard curves of the cycle threshold (CT ) relative to the log of each initial template copy of wx012 was obtained. In the same way, the standard curves of pta y=-0.2118x+4.53 is obtained using 5 times diluted plasmid DNA which contains pta gene. By SYBR GreenⅠ real-time PCR the CT values of wx012 and pta gene in each transgenic wheat was got, the transgene copy number is calculated by comparing the initial template copy of pta to wx012 gene in the same transgenic wheat. The conclusion is, among the seven PCR putative transgenic plants: one was non-transgenic plant，one had one copy number，one had two copies，and the other had three，four copies，respectively. 
Key words: SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative PCR    threshold cycle (Ct )    copy number    wx012； transgenic wheat
收稿日期: 2009-12-01 出版日期: 2010-03-25
基金资助:

甘肃省科技攻关计划项目（2GS035A4100103）资助项目
通讯作者: 张正英     E-mail: Kegc8@sina.com
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李淑洁
张正英

引用本文:

李淑洁 张正英. REAL-TIME PCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数[J]. 中国生物工程杂志, 2010, 30(03): 90-94.

LI Chu-Ji, ZHANG Zheng-Yang. Using REAL-TIME PCR to Determine Transgene Copy Number in Wheat. China Biotechnology, 2010, 30(03): 90-94.

链接本文:

https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/    或    https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2010/V30/I03/90

［1］ Heidc A,Srevrns J. Real time quantitative PCR. Genome Research,1996, 6:986994. 
［2］ Beckerk, Pan D,Whitely C B. Realtime quantitativepolymerase chain reactionto assess gene transfer. HumGeneThe, 1999, 10: 25592566. 
［3］ Giovanna M, Paolo P, Anna M V, et al. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative realtime PCR. BMC Biotechnol，2002，2 (1)：20. 
［4］ 栾凤侠，张洪祥，白 月.应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦. 生物技术，2007，17(4)：4851. Luan F X,Zhang H X, Bai Y.Biotechnology，2007，17(4)：4851. 
［5］ 王关林，方宏筠.植物基因工程.第二版.北京：科学出版社，2002.744. Wang G L，Fang H J.Plant Genetic Engineering, 2nd et. Beijing：Science Press，2002.744. 
［6］ 张驰宇，张高红，杨敏，等.四步法消除SYBR GREEN I 实时定量RTPCR中引物二聚体的影响. 中国生物化学和分子生物学报, 2004，20（3）：387392. Zhang C Y, Zhang G H, Yang M，et al.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2004，20（3）：387392. 
［7］ Weng H B, Pan A H,Yang L T, et al. Estimating number of transgene copies in transgenic rapeseed by realtime PCR assay with HMG I/Y as an endogenous reference gene.Plant Molecular Biology Reporter，2004，22:289300. 
［8］ Ingham D J, Beer S,Miney S, et al. Quantitative realtime PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants. Bio Techniques，2001，31：132140. 
［9］ Song P,Cai C,Skokut M, et al. Quantitative realtime PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERSTMderived transgenic maize.Plant Cell Reports，2002，20：948954. 
［10］ 杨立桃，赵志辉，丁嘉羽，等.利用实时荧光定量PCR法分析转基因水稻外源基因拷贝数. 中国食品卫生杂志，2005，17(2)：140144. Yang L T，Zhao Z H，Ding J Y，et al.Chinese Journal of Food Hygiene，2005，17(2)：140144. 
［11］ 王育花，赵 森，陈 芬，等.利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究.生命科学研究，2007，11(4)：301305. Wang Y H,Zhao S,Chen F,et al.Life Science Research，2007，11(4)：301305. 
［12］ Zhiwu L I, Jennifer L, Hansen, Ying L,et al. Using realtime PCR to determine transgene copy number in wheat. Plant Molecular Biology Reporter，2004，22: 179188.
[1] 任爽, 朱鸿亮. Taqman定量PCR技术检测基因编辑番茄中外源基因拷贝数体系的建立[J]. 中国生物工程杂志, 2017, 37(10): 72-80.
[2] 王瑞钊, 潘才惠, 王颖, 肖文海, 元英进. 高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株的设计与构建[J]. 中国生物工程杂志, 2016, 36(7): 83-91.
[3] 王丽燕, 王煜, 吴坚平, 徐刚, 杨立荣. 腈水合酶NHaseK在大肠杆菌中的功能表达[J]. 中国生物工程杂志, 2016, 36(12): 42-48.
[4] 智晓燕, 汪小锋, 孙永川, 柯锋, 代敏, 闫云君. 多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵[J]. 中国生物工程杂志, 2012, 32(02): 82-89.
[5] 霍楠, 张明辉, 刘营, 仇有文, 敖金霞, 曲波, 高学军. 转基因小麦B73-6-1品系特异性定性 PCR检测方法的建立[J]. 中国生物工程杂志, 2011, 31(10): 100-105.
[6] 李媛, 任长虹, 吴永红, 叶巧, 石锦平, 屈武斌, 郑晓飞, 刘虎岐, 张成岗. 多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2011, 31(06): 93-98.
[7] 彭翼飞,马文丽. 寡核苷酸阵列比较基因组杂交技术及其应用[J]. 中国生物工程杂志, 2006, 26(10): 44-49.
[8] 施农农,王慧中,徐莺,何光源,胡斌. 多重PCR快速确证外源基因在转基因小麦后代的传递[J]. 中国生物工程杂志, 2006, 26(04): 51-57.
[9] 史悦, 于慧敏, 田卓玲, 沈忠耀. 产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究[J]. 中国生物工程杂志, 2005, 25(8): 70-75.
[10] 刘录祥, 赵林姝, 梁欣欣, 郑企成, 刘强, 王晶, 郭会君, 赵世荣, 陈文华. 基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究[J]. 中国生物工程杂志, 2003, 23(11): 53-56.
[11] 门大鹏. 质粒[J]. 中国生物工程杂志, 1993, 13(3): 49-50.
[12] 吴卫星. 细菌质粒的稳定性[J]. 中国生物工程杂志, 1988, 8(5): 27-32.
[13] 方呈祥. 影响生物工程菌发酵产率的因素[J]. 中国生物工程杂志, 1988, 8(4): 22-27.
[14] 陈玉梅. 应用基因技术改进芽孢杆菌α淀粉酶生产[J]. 中国生物工程杂志, 1986, 6(1): 82-83.
[15] ChristopherA.CuUis, CarolJ.Rivin, VirginiaWalbot, 王忆平. 一种检测真核生物基因中重复序列拷贝数的快速步骤[J]. 中国生物工程杂志, 1985, 5(3): 45-48.
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