研究了hAChE基因在毕赤酵母中的表达。设计并合成引物Pb1和P2,以18周龄引产胎儿大脑组织mRNA为模板,经AMV逆转录和高保真PCR,扩增出序列正确的hAChE成熟肽完整基因约1.8kb,经鉴定获得正确构建的分泌型酵母表达栽体pHIL-S1(hAChE),BglⅡ线性化后回收的酵母表达单位经电穿孔法转化入毕赤酵母GS115中,经MD/MM营养表型筛选、提取酵母基因组进行PCR鉴定和含3-酰基吲哚培养基进行表达产物的显色反应,初步筛选出分泌表达有hAChE活性的P.patstoris菌22株。依据hAChE酶活性与3-酰基吲哚显色深浅成正比,在平皿和微量反应板上快捷地筛选出高效表达菌pHIL-S1(AChE)(Ⅰ)-7株,SDS-PAGE分析和Western印迹试验表明,产物分子量约为65kDa,经甲醇诱导摇瓶培养,发酵上清原液rhAChE相对酶活性高达4.0mU/ml,表达量占分泌蛋白总量的23.6%。
全国“十五”医药卫生科研基金重点资助项目(01-Z-023)
马兴元, 谭建华, 魏东芝, 朱平, 孙曼霁. 人脑乙酰胆碱酯酶(hAChE)基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定[J]. 中国生物工程杂志, 2005, 25(7): 54-60.
https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2005/V25/I7/54
Cited