提高糖基化的酶蛋白可结晶性研究 <sup>&#x0002A;</sup>

陈心怡; 刘护; 戴大章; 李春

doi:10.13523/j.cb.1905056

PDF(901 KB)

中国生物工程杂志 ›› 2020, Vol. 40 ›› Issue (3) : 154-162. DOI: 10.13523/j.cb.1905056

综述

提高糖基化的酶蛋白可结晶性研究 ^*

作者信息 +

Strategies to Improve Crystallizability of Glycosylated Enzyme

Author information +

文章历史 +

摘要

糖基化修饰是一类重要的翻译后修饰,对蛋白质的表达调控,折叠,分泌和功能等方面发挥着关键作用.酶是由活细胞产生的具有高度特异性和高效催化性的生物催化剂,酶的糖基化修饰对其生物催化特性和稳定性具有重要影响.研究糖基化修饰对酶蛋白的影响机制需要获取糖基化酶蛋白的结构,X-射线晶体衍射学是获得结构信息的重要技术手段,在糖基化酶蛋白的晶体衍射研究中,复杂,多样,不均一的糖基化修饰限制了该类酶的晶体生长,这是影响糖基化的酶蛋白结构解析的关键瓶颈问题.因此,如何提高糖基化的酶蛋白可结晶性是当前蛋白质结构研究的热点和难点.糖苷酶的去糖基处理,糖基转移酶抑制剂的引入和异源表达体系优化等手段都是当前研究领域提高糖基化的酶蛋白可结晶性的重要策略,这些手段可以在避免损害糖基化的酶蛋白稳定性和催化活性的同时提高其均一性.

Abstract

Glycosylation is an important post-translational modification, which has important effects on expression regulation, folding, secretion and function of the proteins. Glycosylated modification mainly exists in eukaryotes, however it is found that some prokaryotes also possess that modification. Depending on the type of amino acid linked to the sugar chain, glycosylation can be divided into N-glycosylation and O-glycosylation. Enzymes are highly specific and efficient biocatalysts produced by living cells, which are proteins or RNA in chemical nature. The role of glycosylation in the internal structure and external function of enzymes has been a research hotspot in recent years, especially the influence on biocatalytic performance and stability. It has attracted much attention due to its far-reaching significance on the design and modification of enzymes. To understand the mechanism of influence made by glycosylation modification on enzyme structure and biocatalytic activity can provide ideas and directions for rational/semi-rational design and modification of enzyme molecules. X-ray crystallography is one of the main methods to study the structures of glycosylated enzymes, which combine X-ray diffraction and protein crystallography. However, complex sugar chains cause chemical and structural heterogeneity of glycosylated enzymes, which hinders crystal formation and crystal diffraction. Hydrolysis treatment with glycosidase, introduction of glycosyltransferase inhibitors and optimization of heterologous expression system are all important strategies to improve the crystallizability of glycosylated enzymes. These methods can improve the homogeneity of glycosylated enzymes while avoiding the damage to stability and catalytic activity of those.

导出引用

陈心怡, 刘护, 戴大章, 等. 提高糖基化的酶蛋白可结晶性研究 ^*[J]. 中国生物工程杂志, 2020, 40(3): 154-162 https://doi.org/10.13523/j.cb.1905056

Xin-yi CHEN, Hu LIU, Da-zhang DAI, et al. Strategies to Improve Crystallizability of Glycosylated Enzyme[J]. China Biotechnology, 2020, 40(3): 154-162 https://doi.org/10.13523/j.cb.1905056

中图分类号： Q078

酶是一种具有高度特异性和高效催化能力的生物催化剂,其本质是蛋白质或RNA,它们拥有广泛而重要的生理功能,关乎生命体的能量生成,物质转化,细胞增殖等过程^[1,2,3].自然界中有一半以上的真核蛋白都拥有糖基化修饰^[4],糖基化的酶蛋白是拥有糖基化修饰的一类酶.复杂而灵活的糖链对糖基化酶蛋白的分泌,折叠,功能和结构等产生着重要的影响,通过对糖基化的酶蛋白进行结构解析,了解这些影响的机制对酶分子的设计,改造和修饰具有非常关键的意义.

X-射线晶体衍射是一种传统而重要的蛋白质结构研究方法,在Protein Date Bank中,近90%的蛋白质结构都是通过该方法得以解析的.对于糖基化的酶蛋白而言,利用晶体衍射进行结构解析的瓶颈问题主要在于复杂的糖链影响了酶的生化均一性,使得糖基化的酶蛋白很难形成易于衍射的晶体,甚至根本无法结晶.

本文将聚焦于提高糖基化的酶蛋白均一性和可结晶性的手段,综述糖基化的酶蛋白结晶领域的常用研究方法.

1 酶蛋白的糖基化种类和分析方法

1.1 酶蛋白的糖基化种类

蛋白质的糖基化修饰是一种重要而广泛的翻译后修饰,主要存在于真核生物中^[5].根据链接方式的不同,可以将糖基化分为N-糖基化,O-糖基化,C-糖基化和糖基磷脂酰肌醇锚定连接四类^[6,7].在糖基化的酶蛋白中,以N-糖基化为主要糖基化修饰类型,部分酶蛋白也有O-糖基化修饰存在.

N-糖基化在蛋白质中的识别序列十分保守,在特征序列Asn-X-Ser/Thr中,X为除脯氨酸以外的任何一种氨基酸,天冬酰胺残基Asn通过β-1,4-糖苷键与糖链还原端的N-乙酰葡糖胺的酰胺氮连接.N-糖链的结构起始于一个五糖核心,五糖核心由两个N-乙酰葡糖胺和三个甘露糖组成.

生物体中的N-糖基化可以分为三个阶段:(1)内质网内外的糖基转移酶,甘露糖转移酶共同参与完成多糖前体的形成,该前体由寡糖转移酶转移到天冬酰胺残基上;(2)经糖苷酶作用,多糖前体被修剪加工为Man8GlcNAc2糖链;(3)在高尔基体上Man8GlcNAc2被进一步加工.根据加工生物体的不同,Man8GlcNAc2最终形成的N-糖链分为高甘露糖型,低甘露糖型,复合型,杂合型等不同种类.例如,酵母会继续向Man8GlcNAc2糖链上增添甘露糖,形成高甘露糖型N-糖基化;昆虫细胞会截除大部分甘露糖,形成少/低聚甘露糖型N-糖基化;植物细胞可以形成复合型N-糖基化,杂合型N-糖基化和低甘露糖型N-糖基化;哺乳动物细胞会形成带有半乳糖或唾液酸的复合型N-糖基化^[8,9,10]等.

O-糖基化大多是指蛋白质序列中丝氨酸或苏氨酸的羟基通过α-1,4-糖苷键与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)连接开始的黏多糖类O- GalNAc糖基化,除此以外,还有O-GlcNAc,O-mannose等O-糖基化形式^[11].

现发现少数细菌和部分古生菌中也具有糖基化修饰系统^[12],与真核生物的糖基化修饰相比较,原核生物的修饰过程和目的都有不同^[13].传统原核模式菌株缺少糖基化修饰系统,但随着原核生物糖基化修饰领域研究的逐渐深入,原核生物异源表达"定制糖蛋白"可谓前景广阔.

1.2 酶蛋白的糖基化分析方法

在对糖链进行分析的过程中通常需要了解其分子量,单糖成分及连接顺序,构型等情况.常用的糖链分析方法有色谱法和质谱法,利用凝集素亲和层析可以对糖链进行分离并掌握糖链构型和末端结构的性质信息;利用GC-MS可以进行单糖组成的分析;利用LC-MS可以获取糖肽位置信息和糖链结构信息;FAB-MS和LSI-MS都可以测定寡糖的分子量和结构信息;MALDI-MS可以测定糖基化位点和糖链序列;MALDI/TOF-MS可以分析飞摩尔量级的糖肽, et al., et al.以上方法都可以与HPLC,NMR等手段连用,以测定糖链的组成和连接方式,除此以外,红外光谱可以检测糖链中的环状结构和α,β-异头异构结构;毛细管电泳和糖苷酶外切技术可以对糖链进行定性定量;酸水解,糖苷酶水解,稀碱水解等传统手法也可用于对糖链顺序和构型进行分析^{[14,15,16,17,18,19]}.

2 糖基化修饰对酶蛋白催化性能的影响

糖基化修饰在酶蛋白内部结构和外部功能上的作用一直是近年来相关领域的研究热点,尤其是糖基化对酶蛋白在生物催化性能方面的影响,因其在酶蛋白设计,改造和修饰方面的深远意义而备受关注.

2.1 糖基化修饰对酶蛋白稳定性的影响

大量研究表明糖基化修饰对酶蛋白的稳定性有显著影响,李春课题组研究了糖基化修饰对重组β葡糖醛酸糖苷酶稳定性的影响,通过糖苷酶水解法处理重组酶,重组酶的热稳定性降低了15%~45%,虽然其二级结构未发生明显改变,但是热变性中的酶聚集被加剧且过程不可逆^[20,21].Fonseca等^[22]经研究发现,去除重组木聚糖酶的糖基化修饰会将其热稳定性显著降低.有学者定点去除重组脂肪酶第33位的糖基化后发现其耐热性降低了80%^[23].Han等^[24]通过对弹性蛋白酶进行重组表达,发现引入糖基化修饰后提高了其在有机溶剂中的稳定性和热稳定性.有研究通过对黑曲霉的植酸酶进行片段置换,引入了烟曲霉植酸酶对应片段上的糖基化修饰,提高了黑曲霉植酸酶的胰蛋白酶耐受性^[25].Feng等^[26]发现重组β-葡糖醛酸糖苷酶的内在N-糖链形成了"glycol-linkers"结构,该结构不同于糖桥与糖卡,对酶亚基之间的结构紧凑提供了有利帮助(图1).

一般认为,糖基化修饰可以有效减少蛋白质的聚集,有利于酶蛋白的正确折叠,能增加蛋白质的刚性,可以增强多聚体酶亚基之间的作用联系,从而提高该类酶的稳定性^[27,28,29].

图1 "glyco-linkers"对亚基之间作用的影响

Fig.1 The role of "glycol-linkers"on interaction between subunits

Full size|PPT slide

2.2 糖基化修饰对酶蛋白催化活性的影响

酶蛋白的空间结构决定其功能,糖基化修饰通过对酶蛋白构象的作用影响酶蛋白的催化活性.由于糖基化位点在生物体内具有随机性,不同糖基化位点在影响酶蛋白催化活性方面的效果有不同.

Miller等^[30]对内皮脂肪酶进行定点突变,发现对N373,N449和N471位的糖基化位点进行突变,该酶的活性下降了70%,而对N62位的糖基化位点进行突变后,酶活提高了5倍.王小艳等^[31]对β-葡糖醛酸糖苷酶进行糖基化位点引入,构建了三个突变体PGUS-P-26,PGUS-P-35和PGUS-P-259,经与图2所示的结构比对,它们均未引起三级结构的改变,但增加了对底物的亲和力,催化效率分别得到了12.6%,23.9%和30.1%的提高.有学者向重组弹性蛋白酶中引入了三个糖基化位点,构建了突变体I38T,A69T和N266T,N-糖基化修饰只显著提高了I38T的催化活性^[32].

图2 突变体和PGUS-P的结构比对^[31]

Fig. 2 Structural alignment of mutant enzymes and PGUS-P

Red and yellow represent sequence before and after mutation, respectively

Full size|PPT slide

研究表明,糖基化修饰位点在酶蛋白的不同位置发挥的作用有所差别,位于turn/loop区域的糖链可能在一定程度上会增加蛋白质的刚性,有利于其发挥催化活性;向酶蛋白的结构域引入糖基化位点,可能会影响残基之间的相互作用,从而影响酶与底物之间的亲和力^[4,33].

糖基化修饰影响酶蛋白生物催化性能的现象研究在国内外均已广泛开展,除此以外,关于糖基化修饰对酶蛋白折叠,分泌和抗逆性等影响的研究也在同时进行.然而,现阶段该领域的大部分机制研究是基于酶蛋白结构模拟完成的,在很多情况下缺乏酶蛋白构象相关的实际数据支持,糖基化影响酶蛋白生化特性的机制研究仍有待深入.因此,建立高效的糖基化酶蛋白结构分析手段,解析糖基化酶蛋白的结构和催化机制对糖基化酶的设计,改造和修饰具有十分重要的意义^[34].

3 糖基化的酶蛋白结晶方法

目前,X-射线晶体衍射法是获得酶蛋白结构的最常用方法,与冷冻电镜和核磁共振等技术相比,X-射线晶体衍射法具有适用范围广,成本低,不需对酶分子进行特殊标记等优点.在该方法中,获得酶蛋白的结构需要四步:对目标酶蛋白进行单晶制备,衍射数据的收集处理,相位求解和模型的建立修正^[35,36],其中,单晶制备是实现目标蛋白晶体结构解析的关键步骤.

蛋白质的结晶过程是处于过饱和临界点的蛋白质分子聚集成簇后形成晶核,从无序集群到有序结构的重组过程^[37],该过程充满了复杂的物理和化学变化^[38,39,40].

目前研究领域应用到的结晶方法中最常用到的是气相扩散法,如图3所示,在该方法中目标蛋白溶液和结晶池液在密闭空间内通过溶液自身蒸气压趋于平衡来完成蛋白质析出^[37,41].我们通常准备大量不同的条件进行结晶条件筛选,在该过程中,也可伴随使用一些提高蛋白质可结晶性的方法:"籽晶技术"是将劣质的晶体做成籽晶(或晶核),加入与其结晶条件相似但并不完全相同的溶液体系中,该方法改变了化学位移,有利于筛选出可结晶的条件;某些蛋白质修饰可以提高其可结晶性,如赖氨酸残基甲基化可以提高赖氨酸侧链的疏水性,从而降低蛋白质溶解度;利用无机多孔材料或纤维素等多孔天然物质诱导晶体非均相成核可以提高某些蛋白质的可结晶性;向蛋白质体系中加入一些小分子化合物用于稳定蛋白质活性,可以提高获得单晶的概率^[35,42-44].

图3 气象扩散结晶的两种方法

Fig.3 Two methods of meteorological diffusion crystallization

Full size|PPT slide

4 糖基化的酶蛋白结晶瓶颈

在调控蛋白质结晶的过程中,蛋白质本身的生化均一性是影响可结晶性的重要条件,这种均一性不仅要求蛋白质样品浓度高,纯度高,还要求蛋白质分子的构象均一性和化学均一性也要高.而酶蛋白的糖基化修饰中单糖类型复杂但结构,性质相近,具有重复性,糖链柔性普遍较高,对糖基化的酶蛋白结晶产生了限制性影响,这主要体现在:(1)糖链复杂的结构,组成和异构性造成了酶蛋白表面的化学不均一性和结构不均一性,限制了酶蛋白分子的均相成核和有序聚集,也影响了酶蛋白X-射线衍射的特征完整性^[45];(2)糖链的位置多分布在酶蛋白表面,丰富的糖基化对酶蛋白的包裹作用会降低甚至阻止分子间的接触,阻碍晶核产生,降低可结晶性^[46,47].

虽然糖基化修饰的存在对糖基化的酶蛋白结晶及晶体解析造成一定的限制,可它维持着糖基化的酶蛋白结构解析过程中的状态稳定,这主要体现在:(1)在糖基化的酶蛋白天然结构中,部分糖链彼此间与相邻蛋白质侧链之间有丰富的氢键,起到加固蛋白质稳定性的作用,尤其是turn/loop区域的糖链影响着酶蛋白在过饱和溶液中的稳定状态^[48];(2)Dalit等^[49]的研究表明,糖基化修饰可以通过减少蛋白质伸展状态的稳定性提高折叠后的热力学稳定性,这意味着糖基化有利于酶蛋白空间结构的形成和热稳定性的提高.

糖基化修饰对酶蛋白的结晶影响复杂,保留糖基化修饰会影响酶蛋白的生化均一性,放弃糖基化修饰会影响酶蛋白的结构稳定性,如何控制恰当的糖基化修饰程度是获得可结晶糖基化酶蛋白的关键瓶颈问题.

5 提高糖基化的酶蛋白可结晶性策略

根据现有研究成果,我们发现在尽量规避糖链移除的负面影响的条件下,去除糖基化确实有利于提高酶蛋白的可结晶性,而具体的操作手段主要分为以下三种:(1)利用糖苷酶对糖链进行切除;(2)在糖基化的酶蛋白表达过程中加入相关抑制剂阻碍糖基化的正常进行;(3)在异源表达过程中提高糖基化的酶蛋白均一性.相比于N-糖基化,O-糖基化对结晶的影响较小^[50],这里主要就N-糖基化的处理方法进行阐述.

5.1 糖苷酶的去糖基作用

糖苷酶又称糖苷水解酶,专门作用于糖苷键的特异性水解.在糖蛋白的去糖链研究中常用到的糖苷酶有两类:糖苷内切酶(Endo)和肽N-糖酰胺酶(PNGase)^[51,52],其中最常用的为Endo H和PNGase F,这两种糖苷酶的区别如图4所示.Endo H作用于N-糖基化五糖核心最内侧两个甘露糖之间的糖苷键,而PNGase F作用于五糖核心和Asn之间的糖苷键.

图4 Endo H和PNGase F的作用位点

Fig.4 Acting sites of Endo H and PNGase F

Full size|PPT slide

有研究利用Endo H去除了肝素酶表面的6个糖链,获得了肝素酶的蛋白质晶体^[53];Chang等^[50]利用N-糖基化抑制剂和哺乳动物细胞表达对Endo H敏感的糖蛋白,以解决糖蛋白表面糖基的化学不均一和结构不均一;有学者利用Endo H和PNGase F共同完成了对酿酒酵母内糖蛋白的处理,以研究新型糖蛋白在真核生物中的作用^[54].与Endo H相比,PNGase F在非变性条件下效率较低,尽管PNGase F处理过的糖蛋白二级结构,三级结构可能不发生明显的改变,但是它们容易聚集,稳定性较弱,对蛋白酶的敏感性提高;而且如果处理后的蛋白质仍然具有溶解性,那么天冬酰胺残基脱氨形成天冬氨酸会导致蛋白表面具有负电荷,不利于蛋白质形成结晶^[55,56].有学者利用Endo F和PNGase F对哺乳动物乳铁蛋白和血凝素进行了糖链去除和蛋白质结晶,发现不同糖蛋白的N端和C端对糖苷酶去糖作用的敏感性不同^[57].

利用糖苷酶去除糖蛋白表面糖基是一种直接而有效的操作手法,但是其中也存在着一定的问题:(1)纯糖苷酶的价格昂贵,不适用于大规模使用;(2)在去除糖基之后,糖苷酶从体系中的分离较为复杂,提高了分离成本.

有研究利用糖苷酶的重组融合表达解决了以上问题.Grueninger-Leitch等^[58]利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签和PNGase,Endo进行融合表达,提高了N-糖链的移除效率和糖苷酶的分离效率,得到了来源于曲霉菌的植酸酶晶体,来源于黑曲霉的酸性磷酸酶晶体和人源肾素构成的新型晶体.有学者利用GST标签和Endo的融合表达去除了来源于黑曲霉pH2.5的酸性磷酸酶表面糖链,得到了分辨率为2.4Å的酶蛋白晶体^[59].

5.2 关键酶抑制剂的加入

真核生物的糖基化是一个复杂的过程,涉及多种关键酶的共同作用.例如,糖基转移酶,甘露糖转移酶和寡糖转移酶参与内质网上脂多糖前体的形成;糖苷酶参与新生肽上糖链的修剪和加工;糖基转移酶参与高尔基体上糖链的加工成熟.不同生物体所表达关键酶的异同是影响糖链结构,组成和顺序的关键因素^[60,61,62].而在糖蛋白表达的过程中添加关键酶的抑制剂可以有效减少糖基化的复杂性,不均一性,甚至糖基化的产生.

有研究利用生物碱Kifunensine作为甘露糖苷酶的抑制剂,阻碍了哺乳细胞中流感病毒糖蛋白的产生^[63];Broek等^[64]利用α-葡糖苷酶的抑制剂dNM和α-甘露糖苷酶的抑制剂dMM干扰了人体肝癌细胞中抗胰蛋白酶的生物合成,转运和成熟.

5.3 异源表达策略

不同生物体具有不同的糖基化修饰体系,在修饰系统均一的宿主中异源表达糖基化的酶蛋白是解决糖基化不均一的方法之一,酵母,植物细胞,昆虫细胞,仓鼠卵巢细胞(CHO)都常被修饰,改造用于表达哺乳动物的糖蛋白以提高其生化均一性^[8,65-66].植物细胞的翻译后修饰中无O-糖基化,N-糖基化也相对简单,很多重组蛋白上的糖基不均匀需要烦琐的基因组编辑才能消除,而在植物细胞中只需要简单几步操作就能使糖基更加均一^[67].大肠杆菌作为原核生物缺乏糖基化修饰的系统,可以在表达糖基化酶蛋白的过程中不对其进行糖基化修饰.有科学家通过对CHO细胞中负责N-糖基化的同工酶进行筛选和敲除,促进了定制N-糖基化表达模式的实现^[68].Ereño-Orbea等^[56]通过对人胚肾细胞HEK293进行改造,使其失去N-乙酰葡糖胺基转移酶,只能生产高甘露糖型的糖蛋白,通过该改造方法,细胞生产的糖蛋白与未改造时相比,糖链更简单,糖基化规模更小,更容易结晶.Lv等^[69]利用大肠杆菌表达了来源于真菌的糖蛋白β-葡糖醛酸糖苷酶PGUS,并获得了其蛋白质晶体,解析了第一个来源于真菌的β-葡糖醛酸糖苷酶结构.

除了对异源表达宿主进行选择和改造外,在模式生物中通过基因操作去除糖链对糖基化的酶蛋白结晶的干扰也是提高蛋白质可结晶性的常用策略之一.我们可以对N-糖基化位点进行定点突变消除糖基化,一般将糖基化位点的天冬酰胺突变为丙氨酸或谷氨酰胺可以完成对糖基化位点的去除.

受到糖链的影响,糖基化的酶蛋白结晶成功率普遍较低,虽然去除糖链的相关研究为我们带来了新的希望,但其中仍然充满挑战:(1)某些糖链对酶蛋白的天然结构有支撑作用,去除糖链或富含糖链的柔性片段可能对酶蛋白的结构完整性甚至功能稳定性产生负面影响,尤其是turn/loop区的糖基化修饰位点对酶蛋白的稳定性相对重要,有些糖基化的酶蛋白在原核表达或去除糖链后可能形成包涵体,失去催化活性;(2)为了维持去糖基化手段的高效性,很多反应条件中的理化参数并不适宜目标糖基化的酶蛋白展示最佳生理状态^[70];(3)虽然去除糖链有利于维持酶蛋白表面生化均一性,但是糖链的去除会影响酶蛋白的亲水性,表面电荷数和溶解度等生理特性;(4)糖基化修饰位点在酶蛋白结构中的分布存在随机性,并不完全处于蛋白质表面,去糖基化的程度受操作方法的限制,难以得到精确控制.受到以上情况的影响,最终得到的糖基化的酶蛋白结构数据在一定程度上可能有异于目标蛋白的天然状态.

6 结论与展望

糖基化的酶蛋白结晶是研究其晶体结构的最主要瓶颈问题.在当代糖基化的酶蛋白结晶研究中,研究人员或使用糖苷酶切除糖链,或在糖基化的酶蛋白表达过程中控制糖链生成,或改造,选用糖基化均一的修饰系统完成对糖基化酶蛋白的表达,以上方法都是为了去除糖基化的酶蛋白表面的化学不均一性和结构不均一性,尽管这些方法都有一定的成效,但是其中仍然存在一些问题,如随酶蛋白折叠呈现在蛋白质内部的糖链难以去除,糖链的移除对酶蛋白的结构,功能都有着较为严重的影响,异源表达的均一糖基化酶蛋白并非目标蛋白的天然状态, et al., et al.我们期待着有更多有效的工具和手段被开发用于提高糖基化的酶蛋白结晶成功率,不断拓展我们对于糖基化酶蛋白催化机制的了解,丰富我们对于糖链影响糖基化酶蛋白生化功能的知识体系.

参考文献

列表( 原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序 ) 可视化分析

[1]	Nishizuka Y . Studies and perspectives of protein kinase C. Science, 1986,233(4761):305-312. 本文引用 [1]

[2]	Bartel D P . MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell, 2009,136(2):215-233. 本文引用 [1]

[3]	郭晓强 . 酶的研究与生命科学(一):酶本质的理解和认识. 自然杂志, 2014,36(3):208-217. Guo X Q . Enzymes and life science(Ι): understanding the nature of enzyme. Chinese Journal of Nature, 2014,36(3):208-217. 本文引用 [1]

[4]	Apweiler R, Hermjakob H, Sharon N . On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta, 1999,1473(1):4-8. 本文引用 [2]

[5]	Magnelli P, Bielik A, Guthrie E . Identification and characterization of protein glycosylation using specific endo- and exoglycosidases. Journal of Visualized Experiments, 2011,801(58):e3749-e3749. 本文引用 [1]

[6]	Dondoni A, Marra A . Methods for anomeric carbon-linked and fused sugar amino acid synthesis: the gateway to artificial glycopeptides. Chemical Reviews, 2001,100(12):4395-4422. 本文引用 [1]

[7]	王晓龙, 王秀然, 卢天成 . 蛋白质糖基化修饰的研究进展. 基因组学与应用生物学, 2017,36(10):468-472. Wang X L, Wang X R, Lu T C . The research progress of protein glycosylation modification. Genomics and Applied Biologys, 2017,36(10):468-472. 本文引用 [1]

[8]	Betenbaugh M J, Tomiya N, Narang S , et al. Biosynthesis of human-type-glycans in heterologous systems. Current Opinion in Structural Biology, 2004,14(5):601-606. 本文引用 [2]

[9]	Chung C Y, Majewska N I, Wang Q , et al. Snapshot: N-glycosylation processing pathways across kingdoms. Cell, 2017,171(1):258-258. 本文引用 [1]

[10]	Bilova T, Lukasheva E, Brauch D , et al. A snapshot of the plant glycated proteome. Journal of Biological Chemistry, 2016,291(14):7621-7636. 本文引用 [1]

[11]	王胜, 邹霞, 张延 . 基于质谱的蛋白质O-糖基化分析. 化学进展, 2010,22(12):2428-2435. Wang S, Zou X, Zhang Y . Mass spectrometry based analysis of protein O-glycosylation. Progress in Chemistry, 2010,22(12):2428-2435. 本文引用 [1]

[12]	刘志成, 潘超, 朱力 , 等. 原核生物糖基转移酶PglL的研究进展. 生物技术通讯, 2016,27(5):724-727. Liu Z C, Pan C, Zhu L , et al. Progress on glysocyl transferase PglL of prokaryotes. Letters in Biotechnology, 2016,27(5):724-727. 本文引用 [1]

[13]	Eichler J, Koomey M . Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends Microbiol, 2017,25(8):662-672. 本文引用 [1]

[14]	武金霞, 赵晓瑜 . 糖蛋白的结构,功能及分析方法. 生物技术通报, 2004, ( 1):31-34. Wu J X, Zhao X Y . Structure function and analysis methods of glycoprotein. Biotechnology Bulletin, 2004, ( 1):31-34. 本文引用 [1]

[15]	施立楠, 吴军 . 糖蛋白糖链的分析. 生物技术通讯, 2005,16(1):60-63. Shi L N, Wu J . An analysis of saccharide of glysoprotin. Letters in Biotechnology, 2005,16(1):60-63. 本文引用 [1]

[16]

李凤, 管月清, 张艳梅 , 等. 中药多糖及人血清中糖蛋白N-糖链的毛细管电泳指纹图谱研究. 分析测试学报, 2017,36(12):112-117.

, Guan Y

, Zhang Y

, et al. Research on capilary electrophoresis fingerprints of polysaccharides in traditional Chinese medicines and N-glycome in Human Serum Glycoprotein. Journal of Instrumental Analysis, 2017,36(12):112-117.

本文引用 [1]

[17]	陈海霞, 耿美玉, 管华诗 . 细胞膜糖蛋白及其寡糖链分析方法的研究进展. 中国生物工程杂志, 2003,23(3):20-24. Chen H X, Geng M Y, Guan H S . Advances in the analysis of cell membrane glycoproteins and their oligosaccharide chains. Journal of Chinese Biotechnology, 2003,23(3):20-24. 本文引用 [1]

[18]	于晶, 李晓敏, 李红梅 , 等. 糖蛋白糖基化位点及糖型的多重质谱分析. 分析化学, 2015,43(4):564-569. Yu J, Li X M, Li H M , et al. Analysis of glycosylation sites and glycan structure of glycoprotein by multiple mass spectrometric techniques. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015,43(4):564-569. 本文引用 [1]

[19]

卢庄, 王杉, 代景泉 , 等. 基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构. 分析化学, 2006,34(5):591-597.

, Wang

, Dai J

, et al. Primary structure determination of recombinant human erythropoietin by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-time of flight-mass spectrometry. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2006,34(5):591-597.

本文引用 [1]

[20]	Zou S, Xie L, Liu Y , et al. N-linked glycosylation influences on the catalytic and biochemical properties of Penicillium purpurogenum β-d-glucuronidase. Journal of Biotechnology, 2012,157(3):399-404. 本文引用 [1]

[21]	Zou S, Liu G, Kaleem I , et al. Purification and characterization of a highly selective glycyrrhizin-hydrolyzing β-glucuronidase from Penicillium purpurogenum Li-3. Process Biochemistry, 2013,48(2):358-363. 本文引用 [1]

[22]	Fonseca M R, Vieira D S, Alponti J S , et al. Engineering the pattern of protein glycosylation modulates the thermostability of a GH11 xylanase. Journal of Biological Chemistry, 2013,288(35):25522-25534. 本文引用 [1]

[23]	Zhu J, Liu H, Zhang J , et al. Effects of Asn-33 glycosylation on the thermostability of Thermomyces lanuginosus lipase. Journal of Applied Microbiology, 2014,117(1):151-159. 本文引用 [1]

[24]	Han M, Wang X, Ding H , et al. The role of N-glycosylation sites in the activity, stability, and expression of the recombinant elastase expressed by Pichia pastoris. Enzyme & Microbial Technology, 2014,54(1):32-37. 本文引用 [1]

[25]	朱庆锋, 王志林, 崔百元 , 等. 糖基化影响真菌植酸酶的胰蛋白酶耐受性. 华中师范大学学报(自科版), 2016,50(5):746-751. Zhu Q F, Wang Z L, Cui B Y , et al. Glycosylation of fungal phytase affects its resistance to trypsin. Journal of Central China Normal Unicersity(Nat Sci), 2016,50(5):746-751. 本文引用 [1]

[26]	Feng X, Wang X, Han B , et al. Design of glyco-linkers at multiple structural levelsto modulate protein stability. The Journal of Physical Chemistry Letters, 2018,9(16):4638-4645. 本文引用 [1]

[27]	冯旭东, 吕波, 李春 . 酶分子稳定性改造研究进展. 化工学报, 2016,67(1):277-284. Feng X D, Lv B, Li C . Advances in enzyme stability modification. CIESC Journal, 2016,67(1):277-284. 本文引用 [1]

[28]	Yu X W, Wang R, Zhang M , et al. Enhanced thermostability of a Rhizopus chinensis lipase by in vivo recombination in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories, 2012,11(102):1-11. 本文引用 [1]

[29]	Huang L, Xu J H, Yu H L . Significantly improved thermostability of a reductase CgKR1 from Candida glabrata with a key mutation at Asp138 for enhancing bioreduction of aromatic α-keto esters. Journal of Biotechnology, 2015,203(11):54-61. 本文引用 [1]

[30]	Miller G C, Long C J, Bojilova E D , et al. Role of N-linked glycosylation in the secretion and activity of endothelial lipase. Journal of Lipid Research, 2004,45(11):2080-2087. 本文引用 [1]

[31]	王小艳, 樊艳爽, 韩蓓佳 , 等. 糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性. 化工学报, 2015,66(9):3669-3677. Wang X Y, Fan Y S, Han B J , et al. Improvement of thermostability of recombinant β-glucuronidase by glycosylation. CIESC Journal, 2015,66(9):3669-3677. 本文引用 [2]

[32]	Han M, Wang X, Yan G , et al. Modification of recombinant elastase expressed in Pichia pastoris by introduction of N-glycosylation sites. Journal of Biotechnology, 2014,171(1):3-7. 本文引用 [1]

[33]	Holmes N . A splicing switch for T cells. Science, 2008,321(5889):646-647. 本文引用 [1]

[34]	González-Valdez J, Rito-Palomares M, Benavides J . Advances and trends in the design, analysis, and characterization of polymer-protein conjugates for "PEGylaided" bioprocesses. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2012,403(8):2225-2235. 本文引用 [1]

[35]	林亚, 刘志杰, 龚为民 . 蛋白质结构研究. 生命科学, 2007,19(3):289-293. Lin Y, Liu Z J, Gong W M . The research of protein structure. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2007,19(3):289-293. 本文引用 [2]

[36]	Miao J, Charalambous P, Kirz J , et al. Extending the methodology of X-ray crystallography to allow imaging of micrometre-sized non-crystalline specimens. Nature, 1999,400(6742):342-344. 本文引用 [1]

[37]	张辰艳, 尹大川, 鹿芹芹 , 等. 蛋白质结晶条件的筛选策略研究进展. 材料导报, 2010,24(5):22-28. Zhang C Y, Yin D C, Lu Q Q , et al. Research progresses in screening strategies of protein crystal lization. Materials Review, 2010,24(5):22-28. 本文引用 [2]

[38]	Mcpherson A . Introduction to the crystallization of biological macromolecules. Current Topics in Membranes, 2009,63(1):5-23. 本文引用 [1]

[39]	舒占永, 毕汝昌 . 蛋白质晶体的优化生长. 生物化学与生物物理进展, 1997,24(5):396-401. Shu Z Y, Bi R C . Optimizing protein crystallization. Progress in Biochemistry and Biophysics, 1997,24(5):396-401. 本文引用 [1]

[40]	陈瑞卿 . 物理环境影响蛋白质晶体形核的研究进展. 生物工程学报, 2011,27(1):9-17. Chen R Q . Effects of physical environments on nucleation of protein crystals: a review. Chinese Journal of Biotechnology, 2011,27(1):9-17. 本文引用 [1]

[41]	Chayen N, Saridakis E . Protein crystallization: from purified protein to diffraction-quality crystal. Nature Methods, 2008,5(2):147-153. 本文引用 [1]

[42]	刘四化, 王倩倩, 肖良 , 等. 蛋白质结晶方法的研究进展. 中国生化药物杂志, 2011,32(5):405-407. Liu S H, Wang Q Q, Xiao L , et al. Progress in techniques on protein crystallization. Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2011,32(5):405-407. 本文引用 [1]

[43]	冯炜玮, 陈志伟 . 蛋白质结晶及其影响因素研究进展. 安徽农业科学, 2010,38(18):9412-9414. Feng W W, Chen Z W . Research progress on crystallized protein and its impact factors. Journal of Anhui Agriculture and Science. 2010,38(18):9412-9414.

[44]	郭云珠, 刘君, 王燕 , 等. 材料界面诱导蛋白质晶体异相形核的研究进展. 材料导报, 2010,24(23):13-17. Guo Y Z, Liu J, Wang Y , et al. Research progresses of heterogeneous nucleation of protein crystals induced by material surfaces. Materials Review, 2010,24(23):13-17. 本文引用 [1]

[45]	Jimenez-Barbero J , Beatriz F D T, Peng W, et al. Avenues to characterize the interactions of extended N-glycans with proteins by NMR spectroscopy: the influenza hemagglutinin case. Angewandte Chemie International Edition, 2018,57(46):15051-15055. 本文引用 [1]

[46]	Lee J E, Fusco M L, Erica O S . An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols, 2009,4(4):592-604. 本文引用 [1]

[47]	Kwong P D, Wyatt R, Desjardins E , et al. Probability analysis of variational crystallization and its application to gp120, the exterior envelope glycoprotein of type 1 human immunodeficiency virus (HIV-1). Journal of Biological Chemistry, 1999,274(7):4115-23. 本文引用 [1]

[48]	Agirre J, Ariza A, Offen W A , et al. Three-dimensional structures of two heavily N-glycosylated Aspergillus sp. family GH3 β-D-glucosidases. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 2016,72(2):254-265. 本文引用 [1]

[49]	Dalit S B, Yaakov L . Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008,105(24):8256-8261. 本文引用 [1]

[50]	Chang V T, Crispin M, Aricescu A R , et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure, 2007,15(3):267-273. 本文引用 [2]

[51]	Hoek A N V, Wiener M C, Verbavatz J M , et al. Purification and structure-function analysis of native, PNGase F-treated, and endo-.beta.-galactosidase-treated CHIP28 water channels. Biochemistry, 1995,34(7):2212-2219. 本文引用 [1]

[52]	Tucholski J, Simmons M S, Pinner A L , et al. N-linked glycosylation of cortical N-methyl-D-aspartate and kainate receptor subunits in schizophrenia. Neuroreport, 2013,24(12):688-691. 本文引用 [1]

[53]	Wu L, Viola C M, Brzozowski A M , et al. Structural characterization of human heparanase reveals insights into substrate recognition. Nature Structural & Molecular Biology, 2015,12(12):1016-1023. 本文引用 [1]

[54]	Li A K, Tao S C, Jiang Q , et al. Global analysis of the glycoproteome in Saccharomyces cerevisiae reveals new roles for protein glycosylation in eukaryotes. Molecular Systems Biology, 2009,5(1):1-11. 本文引用 [1]

[55]	Zheng K, Bantog C, Bayer R . The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. mAbs, 2011,3(6):568-576. 本文引用 [1]

[56]	Ereño-Orbea J, Sicard T, Cui H , et al. Characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by X-ray crystallography and biophysical techniques. Journal of Visualized Experiments, 2018,137(e57750):1-15. 本文引用 [2]

[57]	Baker H M, Day C L, Norris G E , et al. Enzymatic deglycosylation as a tool for crystallization of mammalian binding proteins. Acta Crystallographica, 2010,50(4):380-384. 本文引用 [1]

[58]	Grueninger-Leitch F, Darcy A, Darcy B , et al. Deglycosylation of proteins for crystallization using recombinant fusion protein glycosidases. Protein Science. 1996,5(12):2617-2622. 本文引用 [1]

[59]	Kostrewa D, Wyss M , D'Arcy A , et al.Crystal structure of Aspergillus niger pH 2.5 acid phosphatase at 2.4Å resolution. Journal of Molecular Biology, 1999,288(5):965-974. 本文引用 [1]

[60]	Helenius A, Aebi M . Intracellular functions of N-linked glycans. Science, 2001,291(5512):2364-2369. 本文引用 [1]

[61]	Ploegh H, Neefjes J J . Protein glycosylation. Current Opinion in Cell Biology, 1991,2(6):1125-1130. 本文引用 [1]

[62]	Antje V S, Julia F, Hisashi K . Role of complex N-glycans in plant stress tolerance. Plant Signaling & Behavior, 2008,3(10):871-873. 本文引用 [1]

[63]	Elbein A D, Tropea J E, Mitchell M , et al. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. Journal of Biological Chemistry, 1990,265(26):15599-15605. 本文引用 [1]

[64]	Broek L A G M, Vermaas D J, Heskamp B M , et al. Chemical modification of azasugars, inhibitors of N-glycoprotein-processing glycosidases and of HIV-I infection: Review and structure-activity relationships. Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 1993,112(2):82-94. 本文引用 [1]

[65]	Lina K, Guan Z Q, Sophie Y D , et al. Two distinct N-glycosylation pathways process the haloferax volcanii S-layer glycoprotein upon changes in environmental salinity. Mbio, 2013,4(6):e00716-13. 本文引用 [1]

[66]	Mehtap A Q, Jerry E . Protein N-glycosylation in archaea: defining haloferax volcanii genes involved in S-layer glycoprotein glycosylation. Molecular Microbiology, 2010,61(2):511-525. 本文引用 [1]

[67]	Schoberer J, Strasser R . Plant glyco-biotechnology. Seminars in Cell & Developmental Biology 2017,80:133-141. 本文引用 [1]

[68]	Zhang Y, Wang S J, Adnan H , et al. Engineered CHO cells for production of diverse, homogeneous glycoproteins. Nature Biotechnology, 2015,33(8):842-844. 本文引用 [1]

[69]	Lv B, Sun H, Huang S , et al. Structure-guided engineering of the substrate specificity of a fungal beta-glucuronidase toward triterpenoid saponins. Journal of Biological Chemistry, 2018,293(2):433-443. 本文引用 [1]

[70]	Schubert M, Aeschbacher T, Zierke M , et al. A secondary structure element present in a wide range of fucosylated glycoepitopes. Chemistry, 2017,23(48):11598-11610. 本文引用 [1]

基金

* 国家杰出青年科学基金(21425624)

国家自然科学基金(21706012)

版权

PDF(901 KB)

2497

Accesses

Citation

Detail

段落导航

收稿日期	修回日期	出版日期
2019-05-31	2019-11-01	2020-03-20
发布日期
2020-04-18

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容